Eine neue Klasse starker Inhibitoren der Na,K-ATPase wurde von uns zuerst aus Helleborus purpurascens isoliert. Indem das Protein in einem bestimmten Zustand blockiert wird, können unbekannte Zwischenzustände des Reaktionszyklus sowie Struktur-Funktionsbeziehungen aufgedeckt werden. Im Gegensatz zu den wohlbekannten Herzglykosid-Inhibitoren der Na,K-ATPase (Digitalis aus dem Fingerhut), inhibieren diese neuen Inhibitoren nicht nur Kaninchen-Na,K-ATPase, sondern mit ähnlicher Wirksamkeit auch Na,K-ATPase aus der Rattenniere, die eine viel niedrigere Affinität für Herzglykoside hat und sogar SR-Ca-ATPase und H,K-ATPase aus dem Magen. Die chemische Struktur der neuen Inhibitoren kann vom einfachen anorganischen Gas Kohlensuboxid (C3O2) abgeleitet werden. Hexamere und Oktamere dieser Substanz bilden makrozyklische Ringe, die als makrozyklische Kohlenstoffsuboxid-Derivate (MCS) bezeichnet werden.
Die Bindestelle der Na,K-ATPase für Herzglykoside ist stark konserviert, und könnte eine mögliche Bindestelle für endogene, digitalisartige Faktoren (EDLF auf Englisch) in Tieren sein. Wegen vielen gemeinsamen chemischen Eigenschaften von MCS-Faktoren und früher beschriebenen EDLFs wurde eine Untersuchungen des Aktionsmechanismus angeregt um eine mögliche Identität der beiden Substanzen zu klären.
Die stark konservierte Herzglykosidbindestelle liegt auf der extrazellulären Seite der Na,K-ATPase. Deshalb war eine der Hauptanforderungen an die MCS-Faktoren, um als EDLF in Betracht zu kommen, dass sie an die extrazelluläre Seite der Na,K-ATPase binden. Experimente mit Na,K-ATPase enthaltenden Lipidvesikeln und Kompetitionsexperimente mit anderen bekannten Inhibitoren weisen darauf hin, dass MCS-Faktoren - im Gegensatz zu Ouabain - eher von der intrazellulären Seite auf die Na,K-ATPase wirken und somit nicht als typischer EDLF in Frage kommen.
Bezüglich des Aktionsmechanismus wurde die Bindung von MCS-Faktoren an die Na,K-ATPase mit dem fluoreszierenden Styrylfarbstoff RH421 untersucht. Der Styrylfarbstoff detektiert Veränderungen in der Membrankapazität, die z.B. durch Ionen verursacht werden, die von Proteinen durch die Membranen transportiert werden. In sogenannten ´Standardexperimenten´ wurden sättigende Konzentrationen von MCS-Faktoren zur Na,K-ATPase hinzugegeben. In diesen Experimenten kann das Protein vornehmlich in den Zuständen H2E1, Na3E1, E2P und (K2)E2 vorliegen. Es wurde beobachtet, dass nur die Konformation E1 von dem Inhibitor beeinflusst wird. Nachfolgende Titrationen der MCS-Faktoren zum Zustand E1, zeigten eine Zunahme der Fluoreszenz in der Größe wie sie erwartet würde, wenn ein Kation aus dem Enzym freigegeben wird. Diese Fluoreszenzzunahme wurde auch in Anwesenheit von Na+- und K+-Ionen beobachtet. Die Größe der Fluoreszenzänderung war abhängig vom pH der Lösung. Ausgehend von einer einfachen Reaktionsgleichung für die Bindung von Protonen an die Na,K-ATPase konnte ein Modell einer Reaktionsgleichung erstellt werden, das in der Lage war, alle experimentell erlangten Daten zu simulieren. Das Modell beinhaltet vier Zustände in denen MCS-Faktoren an die Na,K-ATPase gebunden sind und in denen ebenfalls immer ein Kation an das Enzym gebunden ist. Die Abhängigkeit vom pH wurde darauf zurückgeführt, dass MCS-Faktoren bei niedrigem pH protoniert werden und dadurch in eine aktivere Form überführt werden. Ein ähnlicher, aber viel kleinerer Effekt wurde auch bei höheren Na+- und K+-Konzentrationen beobachtet. Auf diese Veränderungen der Inhibitoraktivität weisen auch die Aktivierungsprozedur und die Enzymaktivitätstests hin, bei denen Veränderungen der Aktivität in Abhängigkeit von Kationenkonzentrationen im Puffer registriert wurden.
Abschließend kann man sagen, dass eine neue Klasse von Inhibitoren der P-Typ ATPasen charakterisiert wurde, die mehrere Typ II P-Typ ATPasen stark inhibiert. Die MCS-Faktoren binden bei der Na,K-ATPase an einer spezifischen Bindestelle auf der zytoplasmatischen Seite des Proteins. Dadurch wird eine Konformationsänderung induziert, die eine Veränderung in der Gleich­gewichts­dis­soziationskonstante für eine der ersten beiden intrazellulären Kationen­bindestellen bewirkt. Nur auf diese Studie basierend, kann den MCS-Faktoren keine physiologische Rolle zugesprochen werden. Die verblüffenden chemischen Ähnlichkeiten der MCS-Faktoren mit vorausgegangenen publizierten Eigenschaften von EDLFs, wurden durch weitere, gemeinsame Eigenschaften bestärkt. Die grundlegende Erwartung an EDLFs an die konservierte extrazelluläre Herzglykosidbindestelle zu binden, konnte von MCS-Faktoren nicht erfüllt werden. Trotzdem bleibt die Tatsache bestehen, dass diese Verbindung in essbaren Pflanzen vorkommt und somit in tierische Körper aufgenommen wird. Diese Studie zeigt eindeutig, dass eine Interaktion zwischen MCS-Faktoren und Typ II P-Typ-ATPasen prinzipiell möglich ist. Ob eine signifikante Interaktion dieser Art tatsächlich stattfindet, wird in physiologischen Studien untersucht werden müssen.

A new class of inhibitors of the Na,K-ATPase from herbal sources was first prepared from the plant Helleborus purpurascens. As the mechanism by which the Na,K-ATPase translocates cations across biological membranes by hydrolyzation of ATP is not yet fully understood, any new inhibitor of the protein has the potential to promote the understanding of this process. By locking the protein in a certain state, intermediate steps in the reaction cycle as well as structure-function relationships might be uncovered. In contrast to the well known cardiac glycoside (CG) inhibitors of the Na,K-ATPase (like digitalis of the foxglove plant), the new inhibitors not only inhibited rabbit Na,K-ATPase but also inhibited with a similar potency rat Na,K-ATPase which has a much lower affinity for cardiac glycosides. Even more surprisingly, MCS factors also inhibited SR Ca-ATPase, and gastric H,K-ATPase with similarly strong binding affinities. The chemical structure of the new inhibitors is described as being derived from the simple inorganic gas carbon suboxide. Hexamers, and octamers of this substance are supposed to form macrocyclic rings called macrocyclic carbon suboxide derivatives (MCS).
The binding site for CG on Na,K-ATPase is strongly conserved and is being discussed for decades as the possible binding site of an endogenous digitalis like factor (EDLF) in animals. A comparison of the chemical properties of MCS factors and previously reported EDLFs isolated from mammals, showed that they share many properties. These similarities made MCS factors a candidate EDLF and thus prompted further investigations on its mechanism of action.
The highly conserved CG binding site is on the extracellular side of the Na,K-ATPase, therefore, one of the main requirements for the MCS factors to be a candidate EDLF is to bind to the extracellular side of the Na,K-ATPase. Experiments with Na,K-ATPase containing lipid vesicles and competition experiments with other known inhibitors indicate that MCS factors - in contrast to ouabain - rather act from the intracellular side on the Na,K-ATPase and thus do not qualify as a typical EDLF.
Regarding the mechanism of action, MCS factor binding to the Na,K-ATPase was investigated with the fluorescent styryl dye RH421. RH421 is known to report changes in membrane capacitance induced e.g. by ions transported through the membrane by transmembrane proteins. First, saturating concentrations of MCS factors were added to Na,K-ATPase in so-called standard experiments where the enzyme can be accumulated predominantly in states H2E1, Na3E1, E2P, and (K2)E2. This led to the observation that only the conformation E1 is affected by the inhibitor. Subsequent titrations of MCS factors to states E1 of the pump cycle showed increases in fluorescence of the size expected when one cation was released from the protein. This fluorescence increase was also observed in presence of Na+ and K+ ions, and its size was dependent on buffer pH. Starting out from a simple reaction sequence for proton binding to the Na,K-ATPase and the introduction of inhibitor bound states it was possible to assemble a model reaction sequence that was able to simulate the experimentally obtained data. The model includes four states where MCS factors are bound to the Na,K-ATPase and where always one cation is bound to the enzyme as well. The dependency on buffer pH was attributed to the MCS factors being protonated and thereby transformed into a more active form. A similar though much smaller effect was also observed at increased Na+ and K+ concentrations. These changes of inhibitor activity were also indicated by the activation procedure and enzyme-activity tests where changes in activity where observed in dependence of cation concentrations in the buffer.
In conclusion, a new class of P-type ATPase inhibitors was characterized that strongly inhibits several type II P-type ATPases. Most probably the MCS factors bind to the Na,K-ATPase at a specific binding site on the intracellular side of the protein thereby inducing a conformational rearrangement that causes a change of the equilibrium dissociation constant for one of the first two intracellular cation binding sites. Based on this study alone, the MCS factors cannot be assigned a physiological role. The intriguing chemical similarities of MCS factors with previously published properties of EDLFs were joined by further characteristics that EDLFs share with MCS factors, yet one substantial requirement for EDLFs, namely, binding to the conserved extracellular CG binding site, could not be met by MCS factors. Nonetheless, the fact remains that these compounds are present in edible plants and thus are to be incorporated into animal bodies. This study shows clearly that an interaction of MCS factors with type II P-type ATPases is principally possible. Whether any interaction of this kind truly occurs to a significant extent will have to be investigated in future physiological surveys.