Die Cytochrom c Nitritreduktasen (ccNir) aus Wolinella succinogenes Wildtyp, K134H-, Q276E-, Y218F- und StopI-Variante wurden sowohl aus der löslichen als auch aus der Membranfraktion zur Homogenität gereinigt. Aus der Membranfraktion wurden sie als Monomer (NrfA) und als Komplex NrfHA mit einem Tetrahäm c-Typ Cytochrom (NrfH) isoliert.
Für die Aktivitäten ergaben sich im Vergleich zum Wildtyp für K134H ein Wert von 35 %, für Q276E 60 % und für Y218F 3 %. Die StopI-Variante war inaktiv. Mittels ICP-MS wurde der Gehalt an Eisen, Calcium und Molybdän bestimmt. Die Q276E-Variante zeigte vergleichbare Werte wie der Wildtyp, die StopI-Variante ergab vier Eisen pro Monomer NrfA, was den Verlust des aktiven Zentrums (Häm 1) bestätigt. Der Molybdängehalt von 2-4 % pro Monomer NrfA lässt auf Verunreinigungen mit Nitratreduktase schließen.
Die spektroskopische Untersuchung der Reaktion von ccNir mit Hydroxylamin,
N- bzw. O-substituierten Derivaten und Hydrazin zeigte, dass ausgehend vom oxidierten Enzym maximal 16 % der ccNir reduziert wurde. Das photochemisch reduzierte Enzym ergab eine spontane Reoxidation mit einer Ausbeute von ca. 90 %. Demzufolge bindet das Hydroxylamin und die N- bzw. O-substituierten Derivate an das Eisenatom von Häm 1 in oxidierter ccNir und reduziert es nicht. Hydrazin bildet eine Ausnahme und reduziert ccNir vollständig.
Die X-Band EPR Spektren von ccNir Wildtyp und der untersuchten Varianten zeigen Resonanzen bei g = 2,98 bis g = 1,46, was auf zwei separate Fe(III) low-spin Häme mit nahezu parallelen Imidazolflächen hinweist. Die Signale bei g = 2,5; 2,15; 1,8 und 1,48 in den Spektren der Q276E- und Y218F-Variante sind mikrowellenfrequenzabhängig, was auf ein spingekoppeltes Paar von zwei S = 1/2 Zuständen hindeutet. Die Resonanzen zwischen g = 3,5 bis g = 3,16 werden Fe(III) low-spin Hämen mit nahezu senkrechten Imidazolflächen zugeordnet. Diese Signale fehlen nur in der StopI-Mutante. Resonanzen bei g = 6, welche auf ein Fe(III) high-spin Häm hinweisen, wurden lediglich in den Spektren vom Wildtyp und der K134H-Variante beobachtet. Weiterhin wurden die Signale bei g = 9,8 und g = 3,8, welche auf ein S = 5/2 1/2 gekoppeltes Paar hinweisen, nur in den Spektren des Wildtyps und der K134H-Variante beobachtet. Jedoch wurde bei der K134H-Variante trotz der Gegenwart des high-spin Signals bei g = 6 und den Signalen bei g = 9,8 und g = 3,8 im Perpendicular Mode , die einer S = 5/2 1/2 Kopplung zugeordnet werden können, kein Signal bei g = 9,8 im Parallel Mode gefunden. Magnetische Suszeptibilitätsmessungen mittels SQUID-Magnetometer von ccNir Wildtyp unterstützen die Annahme einer antiferromagnetischen Kopplung der einzelnen Häm-Zentren.
Die Kristallisation und die räumlichen Strukturen der ccNir K134H-, Q276E- und Y218F-Variante wurden zusammen mit Prof. A. Messerschmidt durchgeführt. Die Gesamtstruktur von NrfA mit Dimerenbildung und a-Helices als überwiegendes Strukturmotiv sowie die Anordnung der fünf Häme wurde durch die Punktmutationen nicht verändert. In der K134H-Variante wurde das für ccNir hoch konservierte Lysin als proximaler Ligand durch Histidin als proximaler Ligand ausgetauscht. Bedingt durch die relative Starrheit der Aminosäureseitenkette und das Aufliegen des aktiven Zentrums (Häm 1) auf Häm 3 ergibt sich ein ungewöhnlich langer Fe-N Bindungsabstand von 2,43 Å zum His 134. Außerdem wird das distale Wasser durch Acetat ausgetauscht, das auch einen verlängerten Bindungsabstand zwischen dem Carboxylsauerstoff und dem Eisen von 2,37 Å hat. In der Q276E-Variante wurde das Glutamin der Calciumbindestelle durch Glutamat ausgetauscht, dessen zwei Sauerstoffatome zweizähnig koordinieren. In dieser Struktur wird ein achtfach koordiniertes Y(III) Ion anstelle des siebenfach koordinierten Ca(II) Ions gefunden. Weiterhin ändert sich das Oberflächenpotential des aktiven Zentrums. In der Y218F-Variante wurde das Tyrosin nahe dem Eisen des aktiven Zentrums durch ein Phenylalanin ausgetauscht. Durch das Fehlen der Hydroxylgruppe kann keine Wasserstoffbrückenbindung zum distalen Liganden aufgebaut werden. Außerdem ist eine Protonenübertragung auf das Substrat nicht mehr möglich, weshalb die Aktivität signifikant sinkt.
In der Struktur des N-Methylhydroxylaminkomplexes der Y218F-Variante ergab sich eine Sauerstoffbindung zum Eisen des aktiven Zentrums (Häm 1) im Vergleich zur Stickstoffbindung beim Hydroxylaminkomplex. Dies steht im Einklang mit DFT-Rechnungen, die von PD Dr. F. Neese durchgeführt wurden. Bei Hydroxylamin wird eine Stickstoffbindung und bei N-Methylhydroxylamin eine Sauerstoffbindung vorhergesagt.
Erste Kristalle des Membran-assoziierten Nitritreduktasekomplexes (NrfHA) aus der Q276E-Variante wurden erhalten. Die Strukturanalyse ist noch in Arbeit.

Cytochrome c nitrite reductases from Wolinella succinogenes wild-type, K134H-, Q276E-, Y218F-, and StopI-variant were purified to homogenity both from the soluble and the membrane fraction. From the membrane fraction they were isolated as a monomer (NrfA) and as a complex NrfHA with a tetraheme c-type cytochrome (NrfH).
Compared to wild-type the activities were for K134H 35 %, for Q276E 60 % and for Y218F 3 %. The StopI-variant was inactive. The metal content (Fe, Ca, Mo) was determined with ICP-MS. The Q276E-variant showed values similar to wild-type, the StopI-variant had four Fe atoms per monomer NrfA which confirmed the deletion of the active site (heme 1). The molybdenum content was 2-4 % per monomer NrfA which can be linked to an impurity with nitrate reductase.
The spectroscopic investigation of the reaction of ccNir with hydroxylamine, its
N- and O-substituted derivatives and hydrazine showed, starting from the oxidized enzyme, that at most 16 % of ccNir became reduced. The photochemically reduced enzyme was reoxidized spontaneously with a yield of about 90 %. Therefore, hydroxylamine and its N- and O-substituted derivatives bind to the iron atom of heme 1 in oxidized ccNir but do not reduce it. As an exception, hydrazine is able to reduce ccNir.
The X-Band EPR spectra of ccNir wild-type and the investigated variants showed resonances at g = 2.98 to g = 1.46 which can be assigned to two separate Fe(III) low-spin hemes with nearly parallel imidazole planes. The signals at g = 2.5, 2.15, 1.8, and 1.48 in the spectra of the Q276E- and the Y218F-variant are microwave frequency dependent, indicating a spin-coupled pair of two S = 1/2 states. The resonances at g = 3.5 to g = 3.16 can be assigned to Fe(III) low-spin hemes with nearly perpendicular imidazole planes. These signals are only missing in the StopI-variant. Resonances at g = 6, which most likely originate from a Fe(III) high-spin heme, were only observed in the spectra of the wild-type enzyme and the K134H-variant. Additionally, signals at g = 9.8 and g = 3.8, which can be assigned to a S = 5/2 1/2 spin-coupled pair, were only observed in the spectra of ccNirWT and ccNirK134H. However, despite of the presence of the high-spin signal at g = 6 and the signals at g = 9.8 and g = 3.8 in the perpendicular mode spectra, which can be assigned to a S = 5/2 1/2 spin-coupled pair, no signal at g = 9.8 in the parallel mode was observed in the spectra of ccNirK134H. Measurements of the magnetic susceptibility with a SQUID-magnetometer of ccNirWT support the presence of antiferromagnetically coupling between the heme centers.
Crystallization and structure determination of ccNir K134H-, Q276E-, and Y218F-variant were carried out in collaboration with Prof. A. Messerschmidt. The overall structure of ccNir with the dimeric architecture and a-helices as the predominant structural motif as well as the arrangement of the five hemes were not changed during site-directed mutagenesis. In the K134H-variant the unusual lysine, which is highly conserved in ccNir as the proximal ligand, was replaced by histidine, which is the typical proximal ligand in c-type cytochromes. Because of the relative inflexibility of the amino acid side chain and the stacking of the active site (heme 1) to heme 3, an unusually long bond distance of 2.43 Å to His 134 is formed. Furthermore, the distal water is replaced by acetate, which has also an elongated bond distance between the carboxyl-oxygen and the active site iron of 2.37 Å. In the Q276E-variant glutamine of the calcium-binding site was exchanged against glutamate. Because of the two oxygens in glutamate it acts as a bidentate ligand. In the structure, an eightfold coordinated Y(III) ion was found instead of a sevenfold coordinated Ca(II) ion. Additionally, the electrostatic surface potential of the active site cavity is changed. In the Y218F-variant the tyrosine close to the active site iron was replaced by phenylalanine. Because there is no hydroxyl-group in phenylalanine, the hydrogen bond to the distal ligand cannot be assembled. Moreover, a proton transfer to the substrate is impossible, thus the activity decreases significantly.
In the structure of the N-methylhydroxylamine complex of the Y218F-variant, the ligand N-methylhydroxylamine coordinates through oxygen to the Fe atom of heme 1, compared to nitrogen in the complex with hydroxylamine. This finding is supported by DFT-calculations carried out by PD Dr. F. Neese. In the hydroxylamine complex a nitrogen binding and in the N-methylhydroxylamine complex a oxygen binding are predicted.
First crystals of the membrane-associated nitrite reductase complex (NrfHA) of the Q276E-variant were obtained. The structure determination is still in progress.