Volume-sensitive Conformational Changes and Multimerization of theNa-K-Cl Cotransporter Tagged with CFP and YFP

Pedersen, Meike

Volume-sensitive Conformational Changes and Multimerization of theNa-K-Cl Cotransporter Tagged with CFP and YFP

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Pedersen.pdfGröße: 3.84 MBDownloads: 196

Datum

2005

Autor:innen

Pedersen, Meike

URI (zitierfähiger Link)

http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-16897

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Open Access-Veröffentlichung

Open Access Green

Sammlungen

Biologie

Titel in einer weiteren Sprache

Zellvolumen abhängige Konformationsänderungen und Multimerisierung des CFP- und YFP-markierten Na-K-Cl Cotransporters

Publikationstyp

Dissertation

Publikationsstatus

Published

Zusammenfassung

The Na-K-Cl cotransporter, NKCC1, is involved in the regulation of intracellular chloride concentration and cell volume. We have tagged both the N terminus and a non-conserved loop in the C terminus of shark NKCC1 with ECFP and EYFP and expressed these constructs in HEK cells. The constructs are fluorescent and correctly trafficked to the cell membrane. We show that NKCC1 with either the N-terminal or the C-terminal tag, as well as NKCC1 with both tags, are active and regulated by intracellular chloride. There is a significant amount of FRET between the two dyes in all cell lines, including cell lines coexpressing two NKCC1s, one fused with a single CFP, and the other one with YFP. The latter result indicates cotransporter multimerization.
There is an increase in FRET upon cell shrinkage. In order to assess the mechanism of the observed FRET changes we have cotransfected NKCC1 with two tags and untagged 'wt NKCC1'. We can show that the amount of FRET is dependent on the ratio of wt NKCC1 to tagged NKCC1. This confirms that part of the FRET signal is due to multimerization of NKCC1 rather than dimerization of GFP. The FRET changes are of the same magnitude in cell lines cotransfected with untagged NKCC1, suggesting that they reflect a conformational change rather than an increase in the tendency to form multimers.
The FRET studies have been carried out with the Q69M mutant of YFP, which has a low chloride sensitivity (Griesbeck et al., 2001). The constructs using regular YFP are quenched by chloride in the 0 to 100 mM range, CFP is not chloride sensitive. The ratio of YFP to CFP fluorescence in cell lines transfected with double-tagged NKCC1 is a dye concentration independent measure of the intracellular chloride concentration in HEK cells.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Der Na-K-Cl Kotransporter, NKCC1, dient der Regulierung der intrazellulären Chloridionenkonzentration und des Zellvolumens. Wir haben ECFP und EYFP an den N-Terminus gekoppelt und in eine wenig konservierte Schleife im C-terminus von NKCC1 eingefügt; die resultierenden Konstrukte wurden in HEK Zellen exprimiert. Die Zellmem-branen der transfizierten Zellen fluoreszieren. Wir können zeigen, dass sowohl NKCC1 Konstrukte die mit einem Farbstoff am N- oder C-Terminus als auch NKCC1 Konstrukte die mit zwei Farbstoffen markiert wurden voll funktionsfähig sind und dass ihre Aktivität durch die intrazelluläre Chloridkonzentration reguliert wird. Wir konnten in allen Zelllinien, auch in denen die mit einem CFP- und einem YFP-markierten Kotransporter kotransfiziert wurden, FRET messen. Daraus folgern wir, dass NKCC1 in Form von Multimeren existiert und funktioniert.
Wenn sich das Zellvolumen verringert, messen wir einen FRET-Anstieg. Wir haben Zellen mit doppelt markiertem und unmarkiertem NKCC1 kotransfiziert, um den Mechanismus dieser FRET-Änderung aufzuklären. In diesen Zellen variiert die Größe des FRET-Signals mit dem Verhältnis von unmarkiertem zu markiertem NKCC1. Dieses Ergebnis bestätigt, dass das FRET-Signal durch Multimerisierung von NKCC1 und nicht durch GFP Dimerisierung ausgelöst wird. Da die Größe der Zellvolumen-abhängigen FRET-Änderungen nicht durch die Kotransfektion von unmarkiertem Kotransporter beeinflusst wurde, ist wahrscheinlich eine Konformationsänderung und nicht eine erhöhte Anzahl von Multimeren der Auslöser dieser FRET-Änderung.
Bei allen Messungen von FRET wurde die Q96M Mutation von YFP benutzt, da diese eine geringere Chloridsensitivität zeigt (Griesbeck et al., 2001). Normales YFP wurde, im Gegensatz zu CFP, von Chloridkonzentrationen zwischen 0 und 100 mM gequencht. In Zell-linien die mit doppelt markiertem NKCC1 transfiziert wurden kann man das Verhältnis von YFP- zu CFP-Fluoreszenz zur Messung der intrazellulären Chloridkonzentration verwenden. Diese relativen Messungen werden durch die Farbstoffkonzentration nicht beeinflusst.

Fachgebiet (DDC)

570 Biowissenschaften, Biologie

Schlagwörter

Zellvolumenregulation, membranetransport, cotransport, fluorescence-resonance-energy-transfer, cell volume regulation

Zitieren

ISO 690

PEDERSEN, Meike, 2005. Volume-sensitive Conformational Changes and Multimerization of theNa-K-Cl Cotransporter Tagged with CFP and YFP [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz

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Prüfungsdatum der Dissertation

September 16, 2005