Von oberflächensterilisierten Schilf-Samen (Phragmites australis) vom Bodensee wurden endophytische Pilze isoliert, die mittels klassischer und molekularer Taxonomie identifiziert wurden. Die meisten dieser Isolate wurden als drei verschiedene Stagonospora-Arten identifiziert. Damit wurde gezeigt, dass in Schilf mehrere Arten samenbürtiger Endophyten vorkommen. Der häufigste Typ (Sequenztyp 4/99-1) hatte innerhalb der aus Samen erhaltenen Isolate einen Anteil von 46%. Er weist eine mit dem Stamm Stagonospora neglecta var. colorata CBS 343.86 übereinstimmende ITS-Sequenz auf.
Für Stagonospora 4/99-1 wurden auf Basis der Variabilität der internal transcribed spacer (ITS) der ribosomalen DNA spezifische PCR-Primer entwickelt. Nested PCR-Analysen zeigten, dass diese Art in Samen je nach Standort und Jahr mit einer Häufigkeit von bis zu ca. 80% vorkommt. Es wurde an Mikrokosmen mit Keimlingen, die aus Samen mit natürlicher Endophytenbefrachtung angezogen wurden, gezeigt, dass der Pilz in Wurzeln und oberirdische Teile der sich entwickelnden Keimlinge einwuchs und somit erfolgreich auf die nächste Wirtsgeneration übertragen wurde.
Das Vorkommen dieser Art wurde an vier Bodensee-Standorten über eine Zeitspanne von drei Jahren durch nested PCR an insgesamt 252 Proben verschiedener Organe von 66 Pflanzen, sowie zusätzlich an Samen untersucht. Die Ergebnisse zeigen an, dass Stagonospora 4/99-1 in Wurzeln und Rhizomen in niedriger Häufigkeit persistiert, während der Vegetationsperiode in den wachsenden Halm aufsteigt, wo er ebenso wie in Blättern im Spätsommer in höherer Häufigkeit vorkommt. Er wächst vermutlich in die Samenanlage ein, um so auf die Nachfolgegeneration übertragen zu werden ( vertikale Transmission ).
Zur Untersuchung des Einflusses Schilf-assoziierter Pilze auf den Wirt wurden Methoden zur Gewinnung axenischer Keimlinge aus Samen entwickelt. In solchen Mikrokosmen wurde ein signifikant verstärktes Wachstum von Schilf nach Inokulation mit Stagonospora und Microdochium über einen Zeitraum von 4-5 Monaten festgestellt. Dies zeigt, dass auch bei Schilf mutualistische Pilze vorkommen, für die eine erbliche Assoziation mit ihrer Wirtspflanze besteht.
Pflanzen aus Mikrokosmen und Keimlinge aus Samen mit natürlicher Pilzbefrachtung wurden zur genauen Lokalisierung des Pilzes immunofluoreszenzmikroskopisch mit einem gegen Stagonospora gerichteten Antikörper untersucht. Die Pilzhyphen wuchsen v.a. zwischen den Epidermiszellen der Wurzeln und in Kontakt mit der ersten Schicht cortikaler Zellen. In Blättern und Halmen von Keimlingen wurde in Parenchym-Geweben das Vorkommen einzelner Hyphen beobachtet. Durch die Lokalisierung im gesunden Pflanzengewebe wurde der endophytische Status des Pilzes bestätigt. Ergebnisse aus in vitro-Kompetitionstests zeigten eine begrenzte Konkurrenzfähigkeit der Stagonospora-Isolate gegen andere Schilf-assoziierte Pilze.
Die erhaltenen Daten deuten insgesamt darauf hin, dass samenbürtige Stagonospora-Arten v.a. bei Schilfkeimlingen eine besondere, möglicherweise temporäre Bedeutung haben. Hierbei können sie aufgrund einer mykorrhizaähnlichen Funktion den jungen, noch nicht durch andere Pilze infizierten Keimlingen bei der Besiedlung neuer Standorte Vorteile verschaffen.
Für weitere Endophyten, Microdochium spp. und Trichoderma sp., wurde an Wurzelproben durch nested PCR eine spezifische Bevorzugung überschwemmter bzw. trockener Habitate gezeigt. Für zwei Vertreter der Gattung Microdochium wurde hierbei eine entgegengesetzte Bevorzugung der unterschiedlichen Habitate gezeigt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich diese nahe verwandten Arten auch hinsichtlich ihrer optimalen Wachstumstemperatur unterscheiden.

Fungal endophytes were isolated from surface-sterilized seeds of reed (Phragmites australis) grown at Lake Constance (Germany). These isolates were identified using both classical and molecular taxomic methods. The majority of isolates was found to belong to three distinct species of the genus Stagonospora. These results indicate that reed harbors several distinct species of seed-borne endophytes. The most frequent isolate (sequence type 4/99-1) contributed 46% to the total number of isolates obtained from seeds. It shows an ITS sequence identical to strain Stagonospora neglecta var. colorata CBS 343.86.
Primers specific for Stagonospora 4/99-1 were developed on the basis of the variability of the internal transcribed spacer (ITS) regions of the ribosomal DNA. Nested PCR analysis revealed that this species occurred with a frequency of up to 80%, depending on site and year. Microcosms with germlings grown from seeds with natural endophyte colonization revealed that the fungus is able to grow into the roots and shoots of the developing germling. This indicates successful transmission to the next generation of the host.
The occurrence of this species was monitored at four sites of Lake Constance over a period of three years using nested PCR. A total of 252 samples of different plant organs originating from 66 plants plus samples from seeds were analyzed. The results indicate that Stagonospora 4/99-1 persits in roots and rhizomes at low frequency and grows into the culm emerging during the vegetation period where it occurs at higher frequencies in late summer. During this time it was also frequently detected in leaf samples. The fungus presumably grows into the ovule in order to get transmitted to the next host generation ( vertical transmission ).
Methods for the generation of axenic seedlings were developed in order to permit investigation of the influence of reed associated fungi on the performance of their host. In such microcosms significantly increased reed growth was detected after inoculation with Stagonospora and Microdochium over a period of 4-5 months. This reveals that mutualistic fungi exist in reed exhibiting a hereditary association with their host plant.
Plants from microcosms and germlings grown from seeds with natural endophyte colonization were analyzed by immunoflourescence microscopy using an antibody directed against Stagonospora in order to permit exact localization of this fungus. Fungal hyphae grew between epidermal cells of roots and in contact with the first layer of cortical cells. In leaves and stems of germlings single hyphae were occasionally detected in parenchymous tissues. The localization in healthy plant tissue confirmed the endophytic status of the fungus. Results from competition experiments revealed a limited competitive ability of the Stagonospora isolates in comparison to other reed-associated fungi.
Altogether the data obtained indicate that seed-borne Stagonospora species have a special and probably temporary importance, especially for reed germlings. They could provide an advantage to young germlings still non-colonized by other fungi in the case of colonization of new sites by a mycorrhiza-like function.
For two other endophytes, Microdochium spp. and Trichoderma sp., specific preference for dry and flooded habitats, respectively, was shown by nested PCR analysis of root samples. For two species of the genus Microdochium an opposite preference for these different habitat types was shown. Additionally, it could be shown that these closely related species exhibit differences concerning their growth temperature optimum, too.