Characterization of the chemokine receptor CCR7 and its role in cell migration
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Zusammenfassung
Die Zellwanderung ist eine grundlegende Eigenschaft der Zellen des Immunsystems, die es ihnen ermöglicht, sich zu einem von Pathogenen verursachten Infektionsherd zu bewegen. Dieser Prozess ist essentiell für die komplexe Interaktion zwischen den Immunzellen, welcher die Immunantwort abstimmt und begrenzt. Die Zellwanderung wird durch die Interaktion zwischen Chemokinrezeptoren mit dem dazugehörigen Chemokinen gesteuert. Diese sind verantwortlich dafür, die Zellen exakt an den entsprechenden Ort zu navigieren. Unter allen Chemokinrezeptoren ist CCR7 für das korrekte Rekrutieren von Lymphozyten und reifen dendritischen Zellen in die lymphatischen Gewebe verantwortlich. Dieser Rezeptor wird von zwei verschiedenen Liganden aktiviert: ELC (CCL19) und SLC (CCL21). Beide CC Chemokine werden von Stromazellen produziert, welche sich in den T-Zell Zonen der Lymphknoten befinden.
Die Rolle von CCR7 im korrekten "homing" von Lymphozyten und dendritischen Zellen wurde ausführlich untersucht. Dennoch gibt es nur wenig Information über die zellbiologische Funktion von CCR7. Deshalb ist der Gegenstand dieser Arbeit die Analyse eines Rezeptors als einzelnes Molekül in einem zellulären Zusammenhang.
Um unsere Fragestellungen zu beantworten, generierten wir einen terminal GFP-markierten CCR7 zur Visualisierung des Rezeptors mittels konfokaler Mikroskopie. Des Weiteren stellten wir ELC und SLC als Fc-Fusionsproteinen her. Beide rekombinanten Proteine wurden aufgereinigt und zeigten biologische Funktionalität, da sie, ähnlich wie die Wildtypchemokine, einen Kalziumeinstrom ins Zytosol und Wanderung von CCR7 exprimierenden Zellen vermitteln. Mit den Werkzeugen, die während meiner Arbeit entwickelt wurden, war es uns möglich, sowohl das zelluläre "trafficking" von CCR7, als auch die Aminosäuren, welche für die Funktion und die Verteilung in der Zelle während der Polarisierung verantwortlich sind, zu untersuchen. Dadurch war es uns möglich, eine Lücke in der Biologie von CCR7 und dem Feld der Chemokine zu schließen.
Um einen besseren Überblick der verschiedenen Themen dieser Arbeit zu bekommen, habe ich sie in drei verschiedene Gebiete unterteilt. Das erste Thema befaßt sich mit der Untersuchung des CCR7 "trafficking" zusammen mit seinem Liganden ELC. In diesen Untersuchungen konnten wir zeigen, dass CCR7 zusammen mit seinem Liganden ELC aufgenommen wird. Im Weiteren wird ELC über Lysosomen abgebaut, wohingegen CCR7 wiederverwendet wird und zurück an die Membran gelangt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung verschiedener Mutanten des C-Terminus von CCR7 und die mögliche Rolle der Ubiquitylierung auf das "trafficking" und die Wanderung. Die Charakterisierung von GFP gekoppeltem CCR7 in wandernden Zellen zusammen mit der Beteiligung an "lipid rafts" wird im dritten Teil der Arbeit beschrieben.
Diese Ergebnisse bieten eine gute Basis, um funktionelle Domänen von CCR7, das "trafficking" und die Verteilung in wandernden Zellen besser definieren zu können.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Cell migration is a fundamental property of immune cells that enables their mobilization to sites of pathogen infection. This process is essential for the complex interaction between immune cells that modulates and restricts the immune response. Cell migration is coordinated by the interaction of chemokines and their receptors, which orchestrate the entire immune system. The chemokine receptor CCR7 is responsible for the proper recruitment of lymphocytes and mature dendritic cells to lymphoid tissues. This receptor is activated by two different ligands: ELC (CCL19) and SLC (CCL21), both CC chemokines that are mainly expressed by stromal cells in the T cell areas of lymph nodes.
The role of CCR7 in the proper homing of lymphocytes and DCs has been described. However, there is only little information on the function of CCR7 on the single cell level. Therefore, our objective in this work was to analyze the receptor from a cell biological point of view.
In order to facilitate the visualization of the receptor by confocal microscopy under different conditions we created a version of tagged CCR7 with a GFP at the C-terminus. Moreover, we generated ELC and SLC as Fc-fusion proteins. Both recombinant proteins were purified and biologically functional as both mediated calcium flux and migration, similar to wild type chemokines in CCR7 expressing cells. With the tools generated during my thesis, we could demonstrate that CCR7 was internalized together with ELC, but then ELC was degraded in lysosomes whereas CCR7 recycled back to the plasma membrane. Moreover we created different mutants of CCR7 demonstrating that the C-terminus of CCR7 is not ubiquitylated and that CCR7 C-terminus is essential for cell migration but not for receptor recycling or endocytosis. Through time laps microscopy using CCR7-GFP we found that the receptor is predominantly localized at one aspect of a chemokine triggered cell. Moreover, we identified that CCR7 constitutively partitions within specialized membrane microdomains, termed lipid rafts, which is required for efficient signal transduction. These results provide a solid base to better define functional domains of CCR7, its trafficking and its distribution on a migrating cell.
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ISO 690
OTERO ACUÑA, Maria Carolina, 2006. Characterization of the chemokine receptor CCR7 and its role in cell migration [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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