Diese Arbeit untersucht die chemischen Grundlagen der Redox-Regulation, d.h. die physiologische Regulation der Enzymaktivität durch oxidative Modifikationen von regulatorischen Enzymen. Durch vorausgehende Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte die zentrale Funktion von Stickstoffmonoxid und Superoxid bei der Entstehung von Peroxynitrit aufgezeigt werden. Peroxynitrit ist für die Nitrierung von Tyrosin verantwortlich und wurde als ein hemmendes Agens für die Prostazyklinsynthase ausgiebig untersucht. Im Gegensatz dazu ist der Mechanismus und die Bedeutung der S-Nitrosierung als eine deutlich häufigere posttranslationale Proteinmodifikation bisher kaum verstanden. Die vorliegenden Daten leisten einen Beitrag zum Verständnis der Chemie solcher Redox-Regulationen, insbesondere durch folgende Ergebnisse:

- Im Gegensatz zu Berichten in der Literatur stellten wir fest, dass Stickstoffmonoxid alleine nicht zu S-Nitrosierung unter physiologischen Bedingungen führen kann. Im Modell der N-Nitrosierung von 2,3-Diaminonaphthalen ist die Gegenwart von Superoxid mit einem optimalen Verhältnis von 2-3:1 von Stickstoffmonoxid zu Superoxid erforderlich, was darauf hinweist, dass entweder N2O3 (3:1) oder eine [NO+]-Spezies (2:1) beteiligt ist. Da der N2O3-spezifische Inhibitor Azid keinen Effekt zeigte, schlagen wir den letzteren Mechanismus vor.

- Aufgrund von Versuchen mit variierenden Verhältnissen zwischen Stickstoffmonoxid- und Superoxid-Bildung nehmen wir an, dass Stickstoffmonoxid mit Peroxysalpetriger Säure (HOONO) reagiert und so zur Bildung des postulierten [NO+]-Spezies führt. Dieses gilt für in situ gebildetes Peroxynitrit, während für die schnelle Zugabe großer Mengen in Gegenwart von Stickstoffmonoxid andere Ergebnisse bekannt sind. Allerdings entspricht letzteres jedoch nicht den physiologischen Bedingungen.

- Es konnte gezeigt werden, dass unter der Verwendung von eingefrorenen Proben erhaltene Daten aus der Literatur über Nitrierungen und Nitrosierungen Artefakte aufweisen. Diese erhöhte Bildung von 3-Nitrotyrosin und S-Nitrosothiolen beruht auf dem Absinken des pH-Werts während des langsamen Einfrierens in der Gegenwart von Natriumphosphatpuffer. Dadurch wird die Bildung von Salpetriger Säure ermöglicht, welche Nitrosierungen, und durch aerobe Oxidation, auch die Bildung von nitrierten Produkten erlaubt.

- Wir postulieren, dass S-Nitrosierungen in der Zelle als eine Vorphase für Oxidationen und Nitrierungen durch Peroxynitrit auftreten. Dieses wird unterstützt durch die beschriebene Blockierung der NADPH- und NADH-Versorgung durch S-Nitrosierungen. Da so die antioxidative Kapazität der Zelle sinkt, würden die entstehenden Bedingungen eine Akkumulation von Peroxynitrit erlauben.

- Durch kinetische Berechnungen wurde das System Stickstoffmonoxid/Superoxid mit dem Ziel der Bestimmung der steady-state Konzentrationen von Peroxynitrit untersucht. Ausgehend von den erhaltenen Daten erscheint es unwahrscheinlich, dass sich unter Ruhebedingungen in der Zelle ausreichende Konzentrationen an Peroxynitrit zur Nitrierung von Tyrosin bilden können. Dieses stützt unsere Hypothese eines vorausgehenden Ausschaltens reduktiver Mechanismen, welches erst die Bildung relevanter Konzentrationen von Peroxynitrit ermöglicht.

- Submikromolare Konzentrationen von Kohlenmonoxid führen zur Tyrosin-Nitrierung, wahrscheinlich der Prostazyklinsynthase, in Gefäßen des Gehirns. Für den verantwortlichen Mechanismus wurden mehrere Möglichkeiten in Betracht gezogen und experimentell untersucht, jedoch ohne abschließende Ergebnisse zu erhalten. Eine andere Möglichkeit wäre, dass CO die Bindung von Stickstoffmonoxid an Myoglobin oder Hämoglobin blockiert und daher die Verfügbarkeit von Stickstoffmonoxid erhöht. Allerdings können unsere Daten eine Stimulation der NOS-1 durch CO nicht ausschließen und ein Öffnen von Kalzium-aktivierten Kalium-Kanälen vom BK-Typ über eine Häm-assoziierte Untereinheit könnte ein anderes mögliches Target von CO darstellen.

Unsere Ergebnisse haben so einen tieferen Einblick in das komplexe Zusammenspiel von Stickstoffmonoxid und Superoxid ermöglicht und liefern daher eine neue Grundlage für das Verständnis der Redox-Regulation.

This work tries to establish a chemical basis for redox regulations, i.e. the physiological regulation of enzyme activity by oxidative modifications of regulatory enzymes. Previous work from our group has highlighted the role of nitric oxide and superoxide in the formation of peroxynitrite, which is responsible for tyrosine nitrations and has been well studied as a physiological inhibitory agent for prostacyclin synthase. In contrast, S-nitrosation reaction as another even more frequent posttranslational modification of proteins is still barely understood with regard to its mechanism and significance. The present data contribute to the chemistry of such redox regulations by the following findings:

- In contrast to literature reports, we find that NO itself is unable to support S-nitrosation under physiological conditions. In presence of superoxide the model of N-nitrosation of 2,3-diaminonaphthalene requires optimal ratios of 2-3:1 of nitric oxide to superoxide indicating that either N2O3 (3:1) or an [NO+] species (2:1) is involved. Since the N2O3-specific inhibitor azide is not effective we propose the latter mechanism.

- Data from experiments with varying ratios of nitric oxide to superoxide generation allow us to suggest that NO reacts with peroxynitrous acid (HOONO) to yield the postulated [NO+] species. This applies for in situ generated peroxynitrite, whereas different results exist for bulk additions in presence of nitric oxide. The latter, however, do not correspond to the physiological situation.

- Literature data on nitrations and nitrosations were shown to contain artifacts if samples were frozen. This enhanced 3-nitrotyrosine and S-nitrosothiol formation occurs by pH-lowering during slow freezing in sodium phosphate buffer, allowing nitrous acid to form and cause nitrosations and by air oxidation also nitrated products.

- We postulate that S-nitrosation occurs in the cell as a pre-stage of oxidations and nitrations by peroxynitrite. This is supported by described blocking effects of S-nitrosations on NADPH and NADH supply. This would create conditions allowing an accumulation of peroxynitrite since the antioxidant capacity of the cell is down-regulated.

- The system nitric oxide/superoxide was subject to kinetic calculations in order to determine steady state concentrations of peroxynitrite. From the data it appeared unlikely that under cellular resting conditions enough peroxynitrite for tyrosine nitrations can accumulate. This strengthens our hypothesis of a switch-off for reducing pathways after which peroxynitrite levels can be build up.

- Carbon monoxide at submicromolar levels was found to cause tyrosine nitration in brain vessels which may represent the nitration of prostacyclin synthase. For the mechanism involved several possibilities were considered and experimentally investigated without obtaining conclusive results. It remains that CO could either block myoglobin or hemoglobin from binding nitric oxide, leaving more nitric oxide available. Our data do not yet exclude a stimulation of NOS-1 by CO and also the opening of big-conductance Ca-activated potassium channels through a heme-containing subunit serves as a possible target of CO.

Overall, our results have provided more insight into the complex behavior of nitric oxide/superoxide interactions and have provided a new basis of redox regulation.