RTP1, das Gen des Rost transferierten Proteins 1 , kodiert für ein 23-25 kDa großes Protein (RTP1p), welches spezifisch von Rostpilz-Haustorien exprimiert und in die pflanzliche Wirtszelle transferiert wird.
In der vorliegenden Arbeit werden Wege des Transfers in die pflanzliche Zelle, Orte der Lokalisation sowie strukturelle und damit verbundene funktionelle Charakteristika des Proteins aufgezeigt.
1.) Ultrastrukturelle Analysen der extrahaustoriellen Membran von Uromyces faba auf Vicia faba und U. striatus auf M. sativa ergaben, dass diese spezialisierte Plasmamembran Einstülpungen in das Cytoplasma hinein aufweist, in welchen sowohl Uf-RTP1p als auch Us RTP1p nahe an der Membran akkumulieren. Dass diese Einstülpungen insbesondere dann auftraten, wenn hohe Konzentrationen von RTP1p im Cytoplasma lokalisiert wurden legt den Schluss nahe, dass diesen Strukturen eine bedeutende Rolle beim Transfer zukommt. Weiter unterstützt wurde die Hypothese durch die Beobachtung, dass diese Membranstrukturen stets eine enge Assoziation zu den pflanzlichen Endomembransystemen aufwiesen.
2.) Lebend-Zell-Mikroskopie der Differenzierung von U. fabae Haustorien in Parenchymzellen von Vicia faba ermöglichte die Einteilung der Interaktion in drei Stadien: Stadium A umfasst die Penetration der Wirtszelle und die Differenzierung eines frühen Haustoriums. In Stadium B setzt ein Längenwachstum des Haustorienkörpers in der Wirtszelle ein und in Stadium C beginnt das Haustorium Fortsätze mit verzweigtem Wuchs auszubilden. Von Stadium B an wurde der Zellkern in dichter Assoziation zum Haustorium lokalisiert. Insbesondere in Stadium C war neben der dichten Interaktion von Haustorium und Zellkern, eine Akkumulationen von Chloroplasten um das Haustorium zu beobachten. Bei der Analyse der Cyclose zeigte sich, dass von diesem Stadium an eine zunehmende Lähmung auftrat.
Immunocytologische Analysen der Entwicklungsstadien ergaben, dass Uf-RTP1p stadienabhängig sekretiert wird. Insbesondere in späten Stadien in denen die Cyclose zum erliegen kam, wurden hohe Konzentrationen von RTP1p sowohl in der extrahaustoriellen Matrix als auch im Cytoplasma lokalisiert.
In elektronenmikroskopischen Analysen dieser Kompartimente wurden an den Orten hoher Uf-RTP1p Konzentrationen sowohl in der extrahaustoriellen Matrix als auch im pflanzlichen Cytoplasma filamentartige Strukturen lokalisiert.
3.) Um zu klären warum RTP1p trotz seiner geringen Größe und vorhergesagten Löslichkeit nicht frei im Cytoplasma diffundiert und ob RTP1p in der Lähmung der Cyclose am Haustorium involviert sein könnte, wurden in silico Analysen durchgeführt. Diese Analysen ergaben eine beta-Aggregationsdomäne im konservierten C-terminalen Bereich des Proteins. Ein synthetisches henicosa Peptid der beta-Aggregationsdomäne wies eine spontane Aggregation zu filamentösen Strukturen auf. Aggregationsversuche mit heterolog in P. pastoris exprimiertem Uf-RTP1p (PiRTP1p) ergaben, dass das heterolog exprimierte Protein amorphe Aggregate ausbildet welche sich über ein Redox-Experiment in Filamente konvertieren ließen. Durch Anwendung des Farbstoffs Thioflavin T zum Nachweis amyloider Proteinaggregate, wurden sowohl die amyloidähnlichen Eigenschaften von PiRTP1p als auch des synthetischen Peptids durch fluoreszenzspektroskopische Analysen aufgezeigt. CD-Spektroskopische Analysen zusammen mit Strukturvorhersagen des synthetischen Peptids ließen für die Aggregationsdomäne eine beta-Strang-Loop-beta-Strang Struktur erkennen. Vergleiche dieses Strukturmotivs mit weiteren Proteinen ergaben, dass diese Motive nicht nur bei der Aggregation von Proteinen eine Rolle spielen, sondern zudem den retrograden Transfer in Zellen durch Bindung an Glykolipide ermöglichen.
RTP1p ist somit das erste Protein eines pathogenen Pilzes, das in den Wirtsorganismus transferiert wird, eine beta-Aggregationsdomäne besitzt und offensichtlich in der Lage ist amyloidähnliche filamentöse Strukturen auszubilden. Aufgrund ihrer beschriebenen Stabilität könnten diese amyloidähnlichen Filamente entscheidende Funktionen in der mechanischen Stabilisierung der Interaktionszone zwischen Pilz und Pflanze aufweisen und den Pilz vor pflanzlicher Abwehr schützen. RTP1p könnte somit für eine Aufrechterhaltung der Biotrophie nötig sein.

RTP1, Rust Transferred Protein 1, encodes a protein of 23-25 kDa. This protein (RTP1p) is exclusively expressed in rust haustoria and transferred into the host cytoplasm.
In this work, transfer mechanisms, sub cellular targets, as well as structural characteristics, and correlations to functional characteristics are presented.
1.) Ultra structural research into the specialised extrahaustorial membrane of Uromyces fabae on Vicia faba and U. striatus on Medicago sativa revealed cytoplasmical invaginations. Uf RTP1p and Us-RTP1p mainly accumulated within these invaginations close to the plasma membrane. For the emergence of these invaginations strongly correlates with the maximum of RTP1p localisation within the plant cytoplasm we postulate, that these structures are involved in transfer of RTP1p. This hypothesis is supported by the close association of the plant endomembrane system with the membrane invaginations.
2.) Stages of U. fabae haustorial development within parenchymatic cells were classified by live cell imaging:
Stage A comprises the host cell penetration and differentiation of an early haustorium. Elongation of the haustorial body defines stage B, while stage C is characterised by branched haustorial lobes extending in the host cell. From stage B onward, the plant nucleus shows close association with the haustorial structures and chloroplasts tend to accumulate around the haustorium-nucleus-complex. At the end of stage C cyclosis seems to be paralysed within infected cells.
Immunocytological analysis revealed a stage dependent localization of RTP1p. Shortly after haustorial differentiation, RTP1p immunosignal occur within the extrahaustorial matrix. Predominantly in stages where plant organelles are closely associated with the haustrorial body and increasing paralysis occurs, high concentrations of RTP1p were detected within the plant cytoplasm.
Fimbriae-like structures showing RTP1p antigenicity were detected by electron microscopy within the extrahaustorial matrix and the plant cytoplasm, corresponding to compartments with high signal intensity in light microscopy.
3.) To find out why the small and hydrophilic RTP1p does not show free diffusion within the plant cytoplasm but shows a gradual distribution instead, was first analysed in silico. A beta-aggregationdomain was identified in the conserved C-terminal part of the protein. In order to find out whether this predicted domain is functional and whether it may be involved in blocking cyclosis of the host cell, a synthetic peptide comprising the predicted domain was design. Designed analysis using this peptide revealed a spontaneous aggregation to amyloid-like filamentous structures. Instead of filaments, amorphous plaques were found, when entire Uf RTP1p was expressed in the heterologous system Picha pastoris. Red-ox-experiments allowed to convert these plaques into filaments. Thioflavin T staining pointed out an amyloid-like characters of both, the filaments formed by the synthetic peptide or the filaments formed by the heterologous protein. CD-spectroscopical analysis as well as structural predictions revealed a beta-sheet-loop-beta-sheet structure of the aggregation domain. Comparative structural analyses have stimulated the idea, that beside being involved in aggregation, the aggregation domain also strongly resembles a glycolipid binding domain. This domain may be involved in the transfer of the protein into the host cytoplasm.
RTP1p is the first protein of a plant pathogenic fungus which is transferred into the host cell possessing a beta-aggregation domain which has the potential to form filaments. Because of their stability, these filaments may be responsible to prevent a collapse of the host cell and protect the haustorium against plant defence. For that we propose, that RTP1p may be qualified as a fungal accommodation factor .