This thesis describes several important advancements in the study of outer membrane proteins (OMPs) interacting with Skp and LPS. In the first study, we characterized the complexes that Skp forms with OMPs and how LPS modulates the surface exposure of Skp-bound OmpA. We used tryptophan fluorescence spectroscopy to study the interactions of wild-type Skp, which is devoid of tryptophan, with several OMPs, namely OmpA, OmpG, and YaeT from E. coli, NalP from Neisseria meningitides, FomA from Fusobacterium nucleatum, and hVDAC1 from human mitochondrial OMs. The fluorescence spectroscopic analysis revealed: (1) The Skp trimer binds the bacterial OMPs independent of the bacterium, but not the mitochondrial hVDAC1. (2) The Skp trimer forms stable complexes with YaeT, OmpG, OmpA and NalP at a 1:1 stoichiometry with nanomolar affinity. (3) Skp binding to OMPs is pH-dependent and OMPs did not display binding with Skp at extreme pH values of ~4 and of ~11. Light scattering experiments indicate that Skp forms a stable trimer from pH 3 to pH 11, indicating an essential electrostatic component in binding of OMPs to Skp. (4) The free energy of binding of Skp to OMP was reduced by ~4 kJ/mol at high salt concentration. This reduction indicates that electrostatic interactions of oppositely charged amino acid residues in OMPs and in Skp contribute to binding. The pH and the salt dependencies of OmpA binding to Skp indicated that complexes are kept together by both hydrophobic and electrostatic forces. (5) Skp efficiently shielded the tryptophans of bound OmpA and the addition of LPS weakened the shielding effect. The LPS binding experiment indicated that LPS modulates the conformation of the OmpA Skp3 complex, partially exposing the fluorescent tryptophans to a more polar environment.
In a second study, the interactions of 13 single tryptophan mutants of OmpA with the chaperone Skp and with LPS were studied in detail by fluorescence spectroscopy. This study led to the following interesting results: (1) For the first time, the topology of the aqueous folding intermediate of OmpA was described on the level of single amino acid residues. The loops and turns of OmpA are more surface-oriented than β-strands. The periplasmic domain is an autonomous folding unit. The location of this fluorescence maximum is not altered upon Skp binding. (2) Skp binds the entire transmembrane domain of OmpA by multivalent interaction. (3) At low LPS/OmpA ratios of 5 mol/mol, the fluorescence spectra of the single tryptophan mutants of OmpA showed only small changes, with Stokes-shifts of about 1.5 and 2 nm for tryptophan in loops 1 and 3. All other mutants did not exhibit any significant changes in the fluorescence spectra. (4) LPS binding to complexes of Skp and OmpA led to a conformational change: the periplasmic β-turns of OmpA are in the most hydrophobic environment, while the loops are in polar environment. The interaction of both, Skp and LPS, gives OmpA a preferred direction, explaining that both Skp and LPS are necessary to facilitate membrane insertion and folding of OmpA into lipid bilayers. (5) OmpA did not develop native structure, neither in binary complexes with Skp nor in ternary complexes with both, Skp and LPS. Membrane insertion is a requirement for folding of OmpA.
In the third chapter, I describe work performed in collaboration with another research group for which I provided the membrane proteins. In this project, polarised attenuated total internal reflection Fourier-transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) was used to determine the orientation of the β-barrels in phosphatidylcholine host matrices of different lipid chainlengths. The linear dichroism of the amide I band from OmpA and FhuA in hydrated membranes generally increased with increasing chain length from diC12:0PC to diC17:0PC phosphatidylcholine, in both the fluid and gel phases. Measurements of the dichroisms of the amide I and amide II bands from dry samples were used to deduce the strand tilt (β = 46° for OmpA, and β = 44.5° for FhuA). These values were then used to deduce the order parameters, , of the β-barrels from the amide I dichroic ratios of the hydrated membranes. The orientational ordering of the β-barrels, and their assembly in the membrane, are discussed in terms of hydrophobic matching with the lipid chains.

Die Dissertationsschrift beschreibt mehrere wichtige Fortschritte für das Verständnis der Wechselwirkung von Skp und LPS mit entfalteten Außenmembranproteinen. In einer ersten Studie habe ich die Komplexe charakterisiert, die Skp mit verschiedenen Außenembranproteinen ausbildet und wie die Wechselwirkung mit LPS zur einer Änderung der Mikroumgebung von Skp-gebundenem OmpA führt. Tryptophan-Fluoreszenz¬spektros¬kopie wurde benutzt, um die Wechselwirkungen von Wild-Typ Skp, das keine Tryptophan¬reste enthält, mit mehreren Außenmembranproteinen zu untersuchen. Zu diesen gehörten die OmpA, OmpG, YaeT aus E. coli, NalP von Neisseria meningitidis, FomA von Fusobacterium nucleatum, und der Spannungs-abhängige Anionen-selektive Kanal VDAC, human isoform 1. Die fluoreszenzspektroskopischen Untersuchungen zeigten: (1) Das trimere Skp bindet die bakteriellen Außenmembranproteine unabhängig von dem Bakterium, aber nicht den mitochondrialen VDAC. (2) Das Skp Trimer bildet stabile 1:1 Komplexe mit YaeT, OmpG, OmpA, und NalP mit nanomolarer Affinität. (3) Die Bindung von Skp an OMPs ist pH-abhängig. Licht-Streuungs-Experimente zeigten, dass Skp auch ein stabiles Trimer bei pH 3 bzw. bei pH 11 ist. Da die Bindung von Skp an OMPs dennoch vom pH-Wert abhängt, muss es eine essentielle elektrostatische Komponente bei der Bindung von Skp an OMPs geben. (4) Die freie Enthalpie der Bindung von Skp an OMPs war bei hohen Ionenstärken um etwa 4 kJ/mol reduziert. Die pH- und Salzabhängigkeit der Bindung von OmpA an Skp zeigte, dass die Komplexe sowohl durch elektrostatische als auch durch hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten werden. (5) Skp schirmte die Tryptophanreste des OmpA effizient gegen Fluoreszenzlöschung und die Zugabe von LPS führte jedoch zur Schwächung dieses Abschirmeffektes. Dies zeigt an, dass die Segmente des OmpA, in den sich die 5 Tryptophanreste befinden, durch die Bindung von LPS an den Komplex der wässerigen Umgebung ausgesetzt werden.
In einer 2. Studie, Die Wechselwirkungen von 13 isolierten Einzeltryptophanmutanten des OmpA mit der Chaperone Skp und mit LPS wurden im Detail mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie studiert, die sehr sensitiv von der Mikroumgebung der Tryptophanreste abhängt. Diese Studie erbrachte die folgenden wichtigen Ergebnisse: (1) Die Topologie des wässerigen Faltungsintermediates von OmpA konnte erstmals auf der Ebene einzelner Aminosäurereste beschrieben werden. Die Schleifen und β-Turns in der wässerigen Form des OmpA im Vergleich zu den β-Strängen eher oberflächen-orientiert. Die periplasmatische Domäne faltete unabhängig von der Transmembrandomäne. Diese Wellen¬länge des Maximums war im Skp-gebundenen Zustand des OmpA unverändert. (2) Die Bindung von Skp an die Transmembrandomäne des OmpA erhöhte die Fluoreszenzintensitäten aller Einzel-Tryptophanmutanten der Transmembran¬domäne und verschob λmax gegenüber der wässerigen Form um 2.5 bis 6 nm zu kürzeren Wellenlängen. (3) Bei niedrigen LPS/OmpA Verhältnissen von 5 mol/mol zeigten die Fluoreszenz¬spektren der Einzel-Tryptophan-Mutanten des OmpA nur geringe durch LPS induzierte Änderungen. Die Stokes-Verschiebungen der Emissions¬maxima lagen zwischen ¬ 1 und 2 nm, für Tryptophan-Reste in den Schleifen 1 und 3. Alle anderen Mutanten zeigten keine signifikanten Änderungen. (4) Die Wechselwirkung des Komplexes aus Skp und OmpA mit LPS resultiert daher in einer Ausrichtung des OmpA: die Mikroumgebung der periplasma¬tischen Turns des OmpA die geringsten Polarität aufwies, während die äußeren Schleifen und β-Strang-Regionen vergleichsweise geringe Stokes-Verschiebungen gegenüber der wässerigen Form des OmpA aufwiesen. (5) OmpA weder in Gegenwart von Skp oder LPS, noch bei gleichzeitiger Gegenwart beider vollständig faltet und OmpA in Lipid-Doppelschichten inseriert und gefaltet wurde.
Im letzten Kapitel dieser Dissertationsschrift beschreibe ich Resultate, die in Zusammenarbeit mit einer anderen Forschungsgruppe erzielt wurden, für die ich die notwendigen Proteine isoliert habe. In dem Projekt wurde polarisierte abgeschwächte interne Totalreflexions Fourier-Transformations Infrarot- (ATR-FTIR) Spektroskopie benutzt, um die Orientierung von β-Fass Membranproteinen in Lipid-Doppelschichten aus Phosphatidylcholinen mit verschiedenen hydrophoben Acylkettenlängen zu bestimmen. Der Lineardichroismus der Amid I Banden von OmpA und FhuA in hydratisierten Membranen nahm in diesen Doppelschichten mit zunehmender Kettenlänge von diC12:0PC zu diC17:0PC sowohl in der Gel- als auch in der fluiden Phase zu. Messungen der dichroismen der Amid I und Amid II Banden von getrockneten Proben wurden benutzt, um die Neigung der β-Stränge, β = 46° für OmpA und β = 44.5° für FhuA, zu bestimmen. Diese Werte wurden dann benutzt, um die Ordnungsparameter, , der β-Fässer aus den dichroitischen Verhältnissen der Amid I Bande in hydratisierten Membranen zu berechnen. Die Ordnung der Orientierung der β-Fässer und ihr Einbau in Membranen werden in diesem Kapitel hinsichtlich der Übereinstimmung der hydrophoben Länge der β¬-Fässer und der hydrophoben Schichtdicke der Membran diskutiert.