Die Kernpore ist ein dynamischer makromolekularer Komplex, dessen strukturelle und funktionelle Eigenschaften je nach physiologischem Zustand der Zelle reguliert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass der Austausch apoptotischer Signal- und Effektormoleküle zwischen Kern und Zytoplasma essentiell für deren Funktion ist, könnte die Regulation dieses Austausches ein Schlüsselelement apoptotischer Signalwege darstellen.

Ziel dieser Arbeit war es, zum Verständnis der Regulation struktureller und funktioneller Veränderungen der Kern-Zytoplasma-Barriere beizutragen. Hierzu wurden drei unabhängige experimentelle Ansätze verfolgt.

Im ersten Ansatz wurde ein in vitro Kernpermeabilitätsassay (NPA) verwendet, um den Einfluss einzelner molekularer Faktoren auf die Kernpermeabilität zu untersuchen. Hierzu wurde der NPA optimiert und validiert um statistisch aussagekräftige Probengrößen untersuchen zu können.
Inhibitorstudien mittels NPA zeigten, dass ein durch den Serinproteaseinhibitor Pefablock inhibierbares Enzym die Kernpermeabilität beeinflusst.
Als potentiell an der Regulation der Kernpermeabilität beteiligte Serinproteasen wurden sowohl Chymotrypsin-ähnliche Proteasen als auch die mitochondriale Serinprotease HtrA2/OMI näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Chymotrypsin-ähnliche Serinproteasen in dem untersuchten apoptotischen System in geringen, aber messbaren Mengen aktiviert werden. Die Aktivität der mitochondrialen Serinprotease HtrA2/OMI konnte nicht durch Pefablock gehemmt werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass HtrA2/OMI einen Einfluss auf die Kernpermeabilität und die proteolytische Prozessierung von Kernporenproteinen hat. Diese Ergebnisse legen nahe, dass, abhängig vom zellulären sowie apoptotischen Modelsystem, unterschiedliche Faktoren einen Einfluss auf die Kernpermeabilität haben.

Im zweiten Ansatz wurde der Einfluss des membranständigen, anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 auf die Kernpermeabilität untersucht. Es wurde in zwei verschiedenen, stabil mit murinem oder humanem Bcl-2 transfizierten Zellinien, sowie nach transienter Transfektion gezeigt, dass Überexpression von Bcl-2 eine basale Erhöhung der Kernpermeabilität zur Folge hat. Dieses Ergebnis wurde mit drei verschiedenen experimentellen Ansätzen verifiziert: NPA, Bead Loading von fluoreszentem 70 kDa Dextran sowie Transfektion des Permeabilitätsmarkers 4xCherry.
Es wurde gezeigt, dass ausschließlich an den Mitochondrien lokalisiertes Bcl-2 keinen Einfluss auf die Kernpermeabilität hat, wohingegen sich die Lokalisation and der ER und/oder Kernmembran als essentiell für die Bcl-2-bedingte Erhöhung der Kernpermeabilität erwies.
Durch Überexpression der Calcium ATPase SERCA in Bcl-2 überexprimierenden Zellen konnte die erhöhte Kernpermeabilität wieder erniedrigt werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Bcl-2 durch Calcium als Signalmolekül eine Erhöhung der Kernpermeabilität vermitteln könnte.

Der dritte Ansatz der vorliegenden Arbeit bestand aus der Entwicklung eines Systems zur Visualisierung und Charakterisierung funktioneller sowie struktureller Veränderungen der Kernpore während der Apoptose mittels konfokaler Lebendzellmikroskopie. Es wurde gezeigt, dass transient mit fluoreszent markierten Kernporenproteinen transfizierte HeLa Zellen ein hierfür geeignetes zelluläres System darstellen. Nup153-GFP, wurde als geeignetes Markerprotein zur Visualisierung der Caspase-abhängigen Proteolyse von Kernporenproteinen identifiziert und validiert. Es konnte gezeigt werden, dass Spaltung an der Caspase-3-Schnittstelle notwendig für den Apoptose-bedingten Verlust von Nup153-GFP von der Kernpore ist. Im Gegensatz dazu, hat eine putative Caspase-8 Schnittstelle keinen Einfluss auf die Verankerung von Nup153-GFP in der Kernpore. Um Apoptose-induzierte Veränderungen der Kernpermeabilität zu visualisieren, wurde ein tetrameres fluoreszentes Markerprotein (4xCherry) hergestellt und als Permeabilitätsmarker validiert.
Mit Nup153-GFP und 4xCherry als fluoreszente Markerproteine wurde eine auf konfokaler Lebendzellmikroskopie basierende Methode entwickelt, welche die spezifischen Anforderungen zur Visualisierung von Veränderungen der Kern-Zytoplasma-Barriere während der Apoptose erfüllt. Zur graphischen Auswertung der Ergebnisse wurde eine entsprechende Bildanalyseprozedur entwickelt.
Mit Hilfe der entwickelten experimentellen Methode konnte gezeigt werden, dass die Kernpermeabilität sich, je nach apoptotischem Modelsystem, zu verschiedenen Zeitpunkten ändert. In zwei untersuchten Modellsystemen erfolgt die caspase-abhängige Spaltung von Kernporenproteinen zu einem späten Zeitpunkt, zeitgleich mit Veränderungen der Chromatinstruktur.

Alterations of NPC structural properties have been found in various cellular systems and following diverse intrinsic and environmental challenges. These changes were associated with selective alterations of functional NPC properties [reviewed in 1]. In light of the finding that nucleocytoplasmic shuttling is essential for apoptotic signaling and execution proteins these alterations might represent a key element of apoptotic pathways [2].

The objective of the present study was to contribute to the understanding of the mechanisms regulating structural and functional alterations of the nucleocytoplasmic barrier in apoptosis. To this end, three independent approaches were devised.

In the first approach an in vitro assay (NPA, Nuclear Permeability Assay) [3] was used to characterise molecular factors affecting nuclear permeability. Inhibitor studies using an optimised version of NPA [4] revealed that an enzyme inhibitable by the general serine protease inhibitor Pefablock influences nuclear permeability.
As potential candidate enzymes, chymotrypsin-like proteases and the mitochondrial serine protease HtrA2/OMI were further analysed. Chymotrypsin-like proteases, known to be inhibited by Pefablock, were found to be activated to a minor degree in the apoptotic system analysed. The mitochondrial serine protease HtrA2/OMI was not inhibitable by Pefablock but was shown to affect nuclear permeability and to induce proteolytic processing of nucleoporins. Altogether, these data suggest that multiple factors may contribute to alterations in nuclear permeability dependent on the cellular setting and the apoptotic model system.

In the second approach the influence of the membrane-anchored, anti-apoptotic protein Bcl-2 on nuclear permeability was investigated. It was found that Bcl-2 overexpression leads to a basal increase in nuclear permeability. This was shown in two different cell lines stably expressing Bcl-2 from mouse or human origin as well as after transient transfection of Bcl-2. The result was confirmed using three independent experimental approaches, namely NPA, Bead Loading of 70 kDa fluorescent dextran, and transfection of the permeability marker 4xCherry. Localization of Bcl-2 at the ER and/or the nuclear envelope, but not at the mitochondria, was found to be essential for the ability of Bcl-2 to alter nuclear permeability. The increase of nuclear permeability by Bcl-2 might be mediated by calcium signalling as it was reversible by overexpression of the calcium ATPase SERCA.

The development of a system to visualize and characterise functional as well as structural changes of the NPC during apoptosis by confocal live cell imaging was the third approach undertaken in this thesis. HeLa cells transiently transfected with fluorescently tagged nucleoporins were found to present a suitable cellular system for this purpose. Nup153-GFP, but not GFP-Nup96, was identified and validated as a marker protein well suited to visualize caspase-dependent nucleoporin-degradation during apoptosis. It was shown that processing at the caspase-3 cleavage-site is necessary to displace Nup153-GFP from the NPC during apoptosis while a putative caspase-8 cleavage-site has no impact on NPC anchorage.
To monitor changes in passive nuclear permeability during apoptosis a tetrameric fluorescent protein (4xCherry) was constructed and validated as a suitable reporter protein.
Using Nup153-GFP and 4xCherry as marker proteins, a live cell imaging procedure was established and specifically designed to meet the demands for the imaging of alterations of the nucleocytoplasmic barrier in single living cells undergoing apoptosis. For evaluation of the obtained results an appropriate image analysis procedure was developed.
Investigations using the developed experimental system revealed that nuclear permeability increases at different time-points depending on the apoptotic model system (early during STS-induced apoptosis but at a late time point during receptor-induced apoptosis). Caspase-dependent nucleoporin degradation occurs late, concomitant with DNA condensation, in both systems.

During the screening for a suitable cellular system, it was found that apoptosis in NRK cells proceeds mainly by caspase-independent mechanisms, that both of the analysed stably transfected fluorescently tagged nucleoporins (POM121, Nup93) are no longer proteolytically processed by caspases and that nucleoporins from rat and human origin are in part processed differently upon apoptosis induction.