Derzeit basieren neurotoxikologische Einstufungen von Chemikalien auf Verhaltens- und Neuropathologischen Untersuchungen. Obwohl diese Studien wissenschaftlich anerkannt sind, sind sie für eine Überprüfung von Chemikalien nicht geeigent. Um diese Einschränkungen zu überwinden, ist es notwendig, stufenweise aufgebaute Teststrategien, die auf in vitro-Systemen basieren, zu entwickeln und einzusetzen. Auf Grund der Komplexität des Nervensystems konnte bisher jedoch noch keine Einigkeit über das Design solcher Strategien erzielt werden.
Die hier vorliegende Studie hatte zum Ziel, neue in vitro -Ansätze und Technologien für die neurotoxikologische Untersuchung von Chemikalien zu entwickeln. Insgesamt wurden drei in vitro-Systeme evaluiert und die Auswirkungen von Chemikalien auf die Mechanismen des Zelltodes (Apoptose), die spezifischen neuronalen Funktionen und die biochemischen Prozesse wurden bewertet.
Durch die Einführung eines humanen Wildtyp (wt) p53-Gen in eine Pheochromocytom 12 (PC 12)-Zelllinie wurde ein in vitro-Testsystem entwickelt, um die p53 vermittelte Zelltoxizität zu erfassen.
Westernblot-Analysen bestätigten eine kontrollierbare Expression des wt p53-Proteins.
Zellen, die das p53-Protein überexprimieren, zeigten eine grössere Sensitivität gegenüber des Topoisomerase-I-Inhibitors Camptothecin, welcher p53 vermittelte Apoptose induziert, im Vergleich zu nicht überexprimierenden Zellen. Dadurch konnte der funktionelle Status des p53-Proteins bestätigt werden.
Eine Überprüfung von 31 metallischen Verbindungen zeigte, dass p53 vermittelte Zelltoxizität durch metallische Verbindungen verursacht wurde, die für ihr krebserregendes Potenzial im Menschen bekannt sind.
Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte PC12-Zelllinie ein geeignetes Testsystem ist, um p53 vermittelte Zelltoxizität festzustellen.
Zweitens wurde ein Testsystem entwickelt, um frühe Effekte von Chemikalien auf neuronale Funktionen nachzuweisen. Das Testsystem basiert auf elektrophysiologischen Messungen der neuronalen Aktivität in brain-aggregates auf Multielektroden-Arrays (MEA). Wenn das System gut standardisiert ist, ist es in der Lage, Daten zu erheben, die in Übereinstimmung mit in vivo gefundenen Auswirkungen sind.
Es konnte gezeigt werden, dass brain-aggregates in der Lage sind, induzierte Aktionspotentiale zu bilden und spontan neuronal zu feuern, was glutaminerge und GABAerge synaptische Übertragung erfordert. Dies konnte durch den Einsatz ihrer synaptischen A- und Antagonisten bestätigt werden.
Behandlungen mit Trimethylzinnchlorid und Methylquecksilberchlorid, Ethanol und Paraoxon beeinträchtigten die neuronale Aktivität ohne Zelltoxizität hervorzurufen, was darauf schliessen lässt, dass Neurotoxizität vor der generellen Toxizität auftritt. Desweiteren waren die Ergebnisse der Studie in Übereinstimmung mit Daten, die in primären, dissoziierten oder Hippocampus-Kulturen erhoben wurden.
Da eine einzige Isolation über 4000 funktionelle Kulturen hervorbringt, enthält diese Methode beide Vorteile der in vivo-ähnlichen Komplexität und einer hohen Durchlaufkapazität.
Das entwickelte Testsystem zeigte elektrophysiologische Aktivitäten, die eine sensitive Erfassung von frühen Effekten auf die neuronale Funktion durch nervenspezifische Giftstoffe möglich machten.
Drittens untersuchten wir, ob der metabolische fingerprint der behandelten Zellen benutzt werden könnte, um Neurotoxizität zu bestimmen. Die Kombination von brain-aggregates und Massenspektrometrie, ist dazu geeignet, eine reichhaltige Einsicht in komplexe biologische Systeme zu gewähren und könnte deshalb wertvolle biochemische Endpunkte für eine neurotoxikologische Einstufung liefern.
Behandlung mit Methylquecksilber Chlorid und Caffein rief konzentrationsabhängig metabolische Veränderungen hervor, beginnend in noch nicht zelltoxischen Konzentrationen.
Veränderungen, hervorgerufen durch Methylquecksilberchlorid und Koffein wurden als γ-Aminobuttersäure, Cholin, Glutamin, Kreatin, Spermin identifiziert und somit als mögliche Biomarker für diese Auswirkungen erkannt.
Biomarkerintensitäten im Stoffwechselprofil zeigten konzentrations-abhängige Veränderungen, die in Übereinstimmung mit dem hypothetischen Mechanismus der Neurotoxizität und der Neuroprotektion sind.
Die Untersuchung von acht Chemikalien mit Toxizität für Leber, Nieren und Gehirn zeigten Zielorgan-abhängige metabolische Störungen, darauf hindeutend, dass das Potenzial dieser Methode darin liegt, neurotoxikologische Substanzen zu identifizieren.
Insgesamt zeigte der Gebrauch von Metabolomics ein grosses Potenzial, um Neurotoxizität festzustellen und neue Biomarker zu entdecken.
Zusammenfassend demonstriert diese Studie die Nützlichkeit der Kombination von Zellkulturmethoden und neuen Technologien, um relevante in vitro-Ansätze zur Feststellung von Neurotoxizität zu kreieren. Ihre biologische Komplexizität, ihr Umfang und ihre Effizienz machen sie relevant, um in Teststrategien integriert zu werden.

Currently, neurotoxicity assessment of chemicals relies on behavioral and neuropathological studies. Although well accepted they are not suitable for systematic testing due to their time consumption, costs and provision of limited mechanistic information. To overcome such limitations, it is generally recommended to develop and make use of tiered testing strategies including in vitro systems. However, consensus has not been reached on the design of such strategies due to the complexity of the nervous system, and the restrictions on endpoints to maintain feasibility.
The present study aimed at developing and assessing the suitability of novel and promising in vitro approaches and technologies to integrate in vitro testing strategies for neurotoxicity testing. Overall, three in vitro systems were studied which evaluated the effects of chemicals on mechanisms of cell death, neuronal function, and biochemical cellular processes in an efficient, comprehensive, and mechanistic manner.
First, a mechanistically-based in vitro test system was developed to detect p53-mediated cytotoxicity by introducing a controllable human wild type p53 gene into a pheochromocytoma 12 (PC12) cell line.
Western blot analyses confirmed a controllable expression of the wt p53 protein.
Cells over-expressing the p53 protein demonstrated a greater sensitivity towards camptothecin, known to induce p53 mediated apoptosis, when compared to non-expressing cells. Thereby, confirming the functional state of the p53 protein.
The screening of 31 metal compounds showed p53-mediated cytotoxicity induced by metal compounds known for their carcinogenicity potential to humans.
As a consequence, the developed PC12 cell line appears to be a useful test system to screen for p53-mediated cytotoxicity.
Secondly, a novel test system was developed based on the electrophysiological recording of neural activity in re-aggregating brain cell cultures using multi-electrode arrays (MEA). This primary cell culture is known to closely resemble the brain s complexity due to its tissue-like organization, be well standardized, and produce neurotoxicity data correlating well with effects observed in vivo.
Cultures were shown to display evoked field potentials and spontaneous neuronal firing involving glutamatergic and GABAergic synaptic transmission by their respective synaptic agonists and antagonists.
Treatments with trimethyltin chloride, methyl mercury chloride, ethanol and paraoxon affected neuronal activities without inducing cytotoxicity, demonstrating that neurotoxicity was detected before general toxicity occurred.
Since a single isolation yields about 4000 recordable cultures the method achieves both in vivo-like complexity and high testing throughput.
Thus, the developed test systems displayed relevant electrophysiological activities that allowed the detection of early effects on neuronal function by neurotoxicants.
Thirdly, re-aggregating brain cell cultures were combined with mass-spectrometry-based metabolomics to evaluate whether metabolic finger-printing could be used to detect neurotoxicity. Metabolomics is recognized to provide a comprehensive insight into complex biological systems and therefore might be valuable biochemical endpoint for neurotoxicity assessment.
Methyl mercury chloride and caffeine induced concentration-dependent metabolic perturbations starting at non-cytotoxic concentrations.
The most prominent perturbations induced by methyl mercury chloride and caffeine were identified and considered as putative biomarkers for their effects.
Biomarker intensities in the metabolic profiles demonstrated concentration-dependent alterations in agreement with hypothesized mechanisms of neurotoxicity and neuroprotection.
The evaluation of 8 compounds with different target organ toxicity largely showed target organ-dependent metabolic perturbations indicating the potential of the approach to identify neurotoxic compounds.
Overall, the use of in vitro metabolomics showed to have great potential to detect comprehensively neurotoxicity and to identify new biomarkers involved in such effects.
In conclusion, this study showed the usefulness of combining advanced cell culture methods and novel methodologies to create relevant in vitro approaches for neurotoxicity testing. Their biological complexity, comprehensiveness, and efficiency make them mechanistically relevant for integration into testing strategies. Moreover, since approaches are complementary to each other they cover a broad range of possible neurotoxic mechanisms. The continuation of this work would be the optimization and validation of the approaches to evaluate their applicability for regulatory testing. Thus, this study shows future prospective of in vitro methods to be integrated into new testing strategies, to cover some of the currently existing gaps of traditional neurotoxicity testing, and to gain mechanistic information on the neurotoxic potential of compounds.