Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts
Lade...
Dateien
Datum
2007
Autor:innen
Herausgeber:innen
ISSN der Zeitschrift
Electronic ISSN
ISBN
3-86628-183-8
Bibliografische Daten
Verlag
Konstanz : Hartung-Gorre
Schriftenreihe
Auflagebezeichnung
URI (zitierfähiger Link)
Internationale Patentnummer
Link zur Lizenz
Angaben zur Forschungsförderung
Projekt
Open Access-Veröffentlichung
Open Access Green
Sammlungen
Core Facility der Universität Konstanz
Titel in einer weiteren Sprache
Strukturelle Studien über Signalproteine: Regulierung des EF-Hand-Proteins S100A2 und Aktivierung des Receptor for Advanced Glycation Endproducts
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
Published
Erschienen in
Zusammenfassung
- S100A2 ist ein Tumorsuppressor und gehört zur Familie der S100 Proteine, welche die größte Untergruppe der Ca(2+)-bindenden EF-Hand Proteine darstellt. Es liegt als Dimer vor und bindet neben Ca(2+) auch Zn(2+) mit hoher Affinität. Bisher gab es keine übereinstimmenden Studien bezüglich Stöchiometrie, Affinität, Geometrie und Lage der Zn(2+) Bindestellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden S100A2 und verschiedene S100A2 Varianten in Escherichia coli exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt. Spektroskopische Untersuchungen zeigten zwei verschiedene Zn(2+) Bindestellen mit jeweils tetraedrischer Koordination. Die erste Bindestelle liegt an der Kontaktfläche der beiden Untereinheiten, wohingegen die zweite Bindestelle durch die Zusammenlagerung zweier S100A2 Dimere gebildet wird. Dies führt zur Bildung eines Tetramers. Die apparente Konstante Kd für Zn(2+) beträgt 25 nM.
Die Ca(2+) Affinitäten wurden durch intrinsische Tyrosinfluoreszenz bestimmt. Mit Kd Werten von ~245 µM für die erste und ~60 µM für die zweite EF-Hand bewegen sich die Ca(2+) Affinitäten in einem Bereich, der auch für andere Ca(2+) Sensor S100 Proteine beobachtet wurde. Zn(2+) Bindung in der zweiten Bindestelle führt jedoch zu einer deutlichen Abnahme (300-fach) der Ca(2+) Affinität der einen und einer geringeren Abnahme (3-fach) der anderen EF-Hand. Daher wird die Ca(2+) Affinität durch Zn(2+) Bindung negativ reguliert.
S100A2 wurde in seiner inaktiven Ca(2+)-freien Form und in seiner aktiven Ca(2+)-gebundenen Form kristallisiert. Die Kristalle beugten bis zu einer Auflösung von 1.6 Å bzw. 1.3 Å. Beide Strukturen zeigen eine für S100 Proteine typische dimere Organisation. Eine Untereinheit besteht aus einer N-terminalen und einer C-terminalen EF-Hand, die durch die sog. Hinge Region verbunden sind. Das Ca(2+) wird pentagonal bipyramidal koordiniert. Durch eine Positionsänderung von Helix III nehmen Helix III und Helix IV eine erheblich unterschiedliche Orientierung im Vergleich zur Ca(2+)-freien Struktur ein. Durch die Bewegung von Helix III öffnet sich eine hydrophobe Einbuchtung zwischen Helix III und Helix IV, die die Bindestelle für Zielproteine wie z. B. p53 darstellt. Diese Bindestelle zeichnet sich im Vergleich zu anderen Ca(2+)-gebundenen S100 Proteinen durch einzigartige Eigenschaften aus: sie weist eine signifikant grössere und tiefere hydrophobe Einbuchtung auf.
2. Der Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) ist ein Zelloberflächenrezeptor. Der extrazelluläre Teil des Rezeptors besteht aus drei immunoglobulin-ähnlichen Domänen: einer V-Typ Domäne und zwei C-Typ Domänen. Eine transmembranäre Helix verbindet den extrazellulären Teil mit der kurzen zytosolischen Domäne. Der Rezeptor bindet eine große Anzahl verschiedener Moleküle, wie advanced glycation endproducts (AGEs), beta-Faltblatt Fibrillen und mehrere S100 Proteine. Die Aktivierung von RAGE spielt eine zentrale Rolle in zahlreichen Krankheiten wie Diabetes, chronischen Entzündungen, Krebs und in der Alzheimer schen Krankheit. Daher wird RAGE als ein potentielles therapeutisches Zielmolekül angesehen.
Drei verschiedene Domänen von RAGE (V-Domäne, V-C1-Domänen und C2- Domäne) wurden exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt. Fluoreszenztitrationen zeigten, dass die V-C1-Domänen notwendig und ausreichend für Ligandenbindung an RAGE sind. Die kinetischen Analysen der Bindung von S100A12 und von ageBSA an die V-C1-Domänen zeigen eine hochaffine Bindung mit schnellen Assoziationsraten, wohingegen die Bindung von Amyloid-beta durch eine langsame Assoziation gekennzeichnet ist. Amyloid-beta dissoziiert allerdings nicht mehr von RAGE, was zu einer irreversiblen Bindung führt.
Kristalle der Ligandenbindedomäne von RAGE (V-C1-Domänen) beugten bis zu einer Auflösung von 1.85 Å. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale der V-C1-Domänen zeigten, dass große positiv geladene Bereiche die Oberfläche dominieren. Daher zieht das Oberflächenpotential von RAGE negativ geladene Moleküle wie AGEs, S100 Proteine oder Amyloid-beta an.
Bisher ist nicht vollständig verstanden wie RAGE aktiviert wird, und wie Signale ins Zellinnere übertragen werden. Es wird vermutet, dass die Signalübertragung durch Rezeptoroligomerisierung vermittelt wird. Ein Aktivierungsmechanismus durch Dimerisierung von RAGE stimmt mit der Anordnung der V-C1-Moleküle im Kristall überein, wo zwei Moleküle seitlich aneinander angeordnet sind. Aufgrund dieser Wechselwirkung von zwei V-C1-Molekülen im Kristall wurden surface plasmon resonance Experimente durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine ausgeprägte Wechselwirkung zwischen zwei V-C1-Molekülen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird folgendes Aktivierungsmodell für RAGE vorgeschlagen: Ligandenbindung an RAGE stabilisiert einen dimeren oder höher multimeren Zustand des Rezeptors. Dadurch nähern sich die zytosolischen Domänen einander an, und induzieren die Bildung einer Signalplattform, die die intrazellulären Signalkaskaden aktivieren kann.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
- S100A2 was identified as a tumor suppressor and belongs to the family of S100 proteins which constitutes the largest subgroup of Ca(2+)-binding EF-hand proteins. It occurs as dimer and beside Ca(2+) it binds Zn(2+) with high affinity. Up to now there was no consensus concerning stoichiometry, affinity, geometry, and location of the Zn(2+)-binding sites.
S100A2 and variants of S100A2 were expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Spectroscopic investigations revealed two different Zn(2+)-binding sites with a tetrahedral coordination. Site 1 is located at the dimeric interface at the surface of S100A2, whereas site 2 is formed by the association of two S100A2 dimers resulting in a tetrameric species. The apparent Kd for Zn(2+) constitutes 25 nM.
The Ca(2+) affinities of S100A2 were determined by intrinsic tyrosine fluorescence. With Kd values of ~245 µM for the first EF-hand and ~60 µM for the second EF-hand the Ca(2+) affinities reside in a similar range as observed for other Ca(2+)-sensor S100 proteins. Zn(2+) binding to site 2 resulted in a dramatic drop (~300-fold) in Ca(2+) affinity of one EF-hand and a smaller drop (~3-fold) of the other EF-hand. Thus, the Ca(2+) affinity of S100A2 is controlled by Zn(2+) in a negative manner.
S100A2 was crystallized in its inactive Ca(2+)-free form and in its active Ca(2+)-loaded form. Crystals diffracted to 1.6 Å and to 1.3 Å, respectively. Both structures showed a dimeric organization typical for S100 proteins. One subunit consists of an N-terminal and a C-terminal EF-hand which are connected by the so-called hinge region. The Ca(2+) ions are coordinated in a pentagonal bipyramidal manner. Compared to the Ca(2+)-free form, helix III and helix IV show a significantly different orientation as a result of a repositioning of helix III. The movement of helix III opens a hydrophobic cavity between helices III and IV which constitutes the binding site for targets like p53. This binding site exhibits unique features compared to other Ca(2+)-bound S100 proteins: it is characterized by a significantly larger and deeper hydrophobic cavity.
2. The Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) is a cell surface receptor. The extracellular moiety of the receptor is composed of three immunoglobulin-like domains: one V-type domain and two C-type domains. A single transmembrane helix connects the extracellular part with the short cytosolic domain. RAGE has the unusual property to bind a large range of different molecules such as advanced glycation endproducts (AGEs), beta-sheet fibrils , and several S100 proteins. RAGE activation has been implicated as a progressive factor in several disorders including diabetes, chronic inflammation, cancer and Alzheimer s disease. Therefore RAGE is regarded as a potential therapeutic target in a various number of diseases.
Three different domains (V domain, V-C1 domains and C2 domain) were expressed and purified to homogeneity. Fluorescence titrations demonstrated that the V-C1 domains are necessary and sufficient for ligand binding to RAGE. The kinetic analysis of ligand binding to V-C1 domains revealed high affinity binding with fast association rates for S100A12 and glycated BSA, whereas binding of amyloid-beta is characterized by a slow association. However, amyloid-beta did not dissociate from RAGE resulting in an irreversible binding.
Crystals of the ligand binding domain of RAGE (V-C1 domains) diffracted to 1.85 Å and the structure was determined by multiple anomalous dispersion (MAD) using Zn(2+) as anomalous scatterer. The electrostatic surface potential of V-C1 domains revealed that the surface is dominated by large positively charged patches. Thus, the surface potential of RAGE can act like a trap in attracting negatively charged molecules, such as AGEs, S100 proteins or amyloid-beta. The large variety of cellular responses might be explained by different binding sites for the different ligands.
Up to now it is rarely understood how RAGE is activated and transfers signals into the cell. It is proposed that RAGE signaling is mediated by ligand-induced receptor oligomerization. An activation mechanism via RAGE dimerization is consistent with the arrangement of V-C1 molecules in the crystal where two molecules are arranged side-by-side. Based on this interaction of two V-C1 proteins in the crystal, surface plasmon resonance experiments were performed which revealed a tight interaction between two V-C1 molecules. These findings led to the following model for RAGE activation: ligand binding to RAGE stabilizes a dimeric or even higher multimeric state of RAGE. Thereby, the cytosolic domains of RAGE approximate which induces the formation of a signaling platform which can activate the intracellular signal-transducing cascade.
Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
RAGE, AGEs, Rezeptordimerisierung, S100 Proteine, S100A2, RAGE, AGEs, receptor dimerization, S100 proteins, S100A2
Konferenz
Rezension
undefined / . - undefined, undefined
Zitieren
ISO 690
KOCH, Michael, 2007. Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz. Konstanz : Hartung-Gorre. ISBN 3-86628-183-8BibTex
@phdthesis{Koch2007Struc-7006,
year={2007},
publisher={Konstanz : Hartung-Gorre},
title={Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts},
author={Koch, Michael},
address={Konstanz},
school={Universität Konstanz}
}RDF
<rdf:RDF
xmlns:dcterms="http://purl.org/dc/terms/"
xmlns:dc="http://purl.org/dc/elements/1.1/"
xmlns:rdf="http://www.w3.org/1999/02/22-rdf-syntax-ns#"
xmlns:bibo="http://purl.org/ontology/bibo/"
xmlns:dspace="http://digital-repositories.org/ontologies/dspace/0.1.0#"
xmlns:foaf="http://xmlns.com/foaf/0.1/"
xmlns:void="http://rdfs.org/ns/void#"
xmlns:xsd="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#" >
<rdf:Description rdf:about="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/7006">
<dc:date rdf:datatype="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#dateTime">2011-03-24T17:30:48Z</dc:date>
<void:sparqlEndpoint rdf:resource="http://localhost/fuseki/dspace/sparql"/>
<dc:rights>terms-of-use</dc:rights>
<bibo:uri rdf:resource="http://kops.uni-konstanz.de/handle/123456789/7006"/>
<dspace:isPartOfCollection rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/28"/>
<bibo:issn>3-86628-183-8</bibo:issn>
<dcterms:issued>2007</dcterms:issued>
<dcterms:available rdf:datatype="http://www.w3.org/2001/XMLSchema#dateTime">2011-03-24T17:30:48Z</dcterms:available>
<dcterms:hasPart rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/bitstream/123456789/7006/1/Diss_MKoch.pdf"/>
<dcterms:rights rdf:resource="https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/"/>
<dspace:hasBitstream rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/bitstream/123456789/7006/1/Diss_MKoch.pdf"/>
<dcterms:title>Structural insights into signal-transducing proteins : Regulation of the EF-hand protein S100A2 and activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts</dcterms:title>
<foaf:homepage rdf:resource="http://localhost:8080/"/>
<dc:contributor>Koch, Michael</dc:contributor>
<dc:format>application/pdf</dc:format>
<dc:creator>Koch, Michael</dc:creator>
<dc:publisher>Konstanz : Hartung-Gorre</dc:publisher>
<dcterms:abstract xml:lang="deu">1. S100A2 ist ein Tumorsuppressor und gehört zur Familie der S100 Proteine, welche die größte Untergruppe der Ca(2+)-bindenden EF-Hand Proteine darstellt. Es liegt als Dimer vor und bindet neben Ca(2+) auch Zn(2+) mit hoher Affinität. Bisher gab es keine übereinstimmenden Studien bezüglich Stöchiometrie, Affinität, Geometrie und Lage der Zn(2+) Bindestellen.<br />In der vorliegenden Arbeit wurden S100A2 und verschiedene S100A2 Varianten in Escherichia coli exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt. Spektroskopische Untersuchungen zeigten zwei verschiedene Zn(2+) Bindestellen mit jeweils tetraedrischer Koordination. Die erste Bindestelle liegt an der Kontaktfläche der beiden Untereinheiten, wohingegen die zweite Bindestelle durch die Zusammenlagerung zweier S100A2 Dimere gebildet wird. Dies führt zur Bildung eines Tetramers. Die apparente Konstante Kd für Zn(2+) beträgt 25 nM.<br />Die Ca(2+) Affinitäten wurden durch intrinsische Tyrosinfluoreszenz bestimmt. Mit Kd Werten von ~245 µM für die erste und ~60 µM für die zweite EF-Hand bewegen sich die Ca(2+) Affinitäten in einem Bereich, der auch für andere Ca(2+) Sensor S100 Proteine beobachtet wurde. Zn(2+) Bindung in der zweiten Bindestelle führt jedoch zu einer deutlichen Abnahme (300-fach) der Ca(2+) Affinität der einen und einer geringeren Abnahme (3-fach) der anderen EF-Hand. Daher wird die Ca(2+) Affinität durch Zn(2+) Bindung negativ reguliert.<br />S100A2 wurde in seiner inaktiven Ca(2+)-freien Form und in seiner aktiven Ca(2+)-gebundenen Form kristallisiert. Die Kristalle beugten bis zu einer Auflösung von 1.6 Å bzw. 1.3 Å. Beide Strukturen zeigen eine für S100 Proteine typische dimere Organisation. Eine Untereinheit besteht aus einer N-terminalen und einer C-terminalen EF-Hand, die durch die sog. Hinge Region verbunden sind. Das Ca(2+) wird pentagonal bipyramidal koordiniert. Durch eine Positionsänderung von Helix III nehmen Helix III und Helix IV eine erheblich unterschiedliche Orientierung im Vergleich zur Ca(2+)-freien Struktur ein. Durch die Bewegung von Helix III öffnet sich eine hydrophobe Einbuchtung zwischen Helix III und Helix IV, die die Bindestelle für Zielproteine wie z. B. p53 darstellt. Diese Bindestelle zeichnet sich im Vergleich zu anderen Ca(2+)-gebundenen S100 Proteinen durch einzigartige Eigenschaften aus: sie weist eine signifikant grössere und tiefere hydrophobe Einbuchtung auf.<br /><br />2. Der Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) ist ein Zelloberflächenrezeptor. Der extrazelluläre Teil des Rezeptors besteht aus drei immunoglobulin-ähnlichen Domänen: einer V-Typ Domäne und zwei C-Typ Domänen. Eine transmembranäre Helix verbindet den extrazellulären Teil mit der kurzen zytosolischen Domäne. Der Rezeptor bindet eine große Anzahl verschiedener Moleküle, wie advanced glycation endproducts (AGEs), beta-Faltblatt Fibrillen und mehrere S100 Proteine. Die Aktivierung von RAGE spielt eine zentrale Rolle in zahlreichen Krankheiten wie Diabetes, chronischen Entzündungen, Krebs und in der Alzheimer schen Krankheit. Daher wird RAGE als ein potentielles therapeutisches Zielmolekül angesehen.<br />Drei verschiedene Domänen von RAGE (V-Domäne, V-C1-Domänen und C2- Domäne) wurden exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt. Fluoreszenztitrationen zeigten, dass die V-C1-Domänen notwendig und ausreichend für Ligandenbindung an RAGE sind. Die kinetischen Analysen der Bindung von S100A12 und von ageBSA an die V-C1-Domänen zeigen eine hochaffine Bindung mit schnellen Assoziationsraten, wohingegen die Bindung von Amyloid-beta durch eine langsame Assoziation gekennzeichnet ist. Amyloid-beta dissoziiert allerdings nicht mehr von RAGE, was zu einer irreversiblen Bindung führt.<br />Kristalle der Ligandenbindedomäne von RAGE (V-C1-Domänen) beugten bis zu einer Auflösung von 1.85 Å. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale der V-C1-Domänen zeigten, dass große positiv geladene Bereiche die Oberfläche dominieren. Daher zieht das Oberflächenpotential von RAGE negativ geladene Moleküle wie AGEs, S100 Proteine oder Amyloid-beta an.<br />Bisher ist nicht vollständig verstanden wie RAGE aktiviert wird, und wie Signale ins Zellinnere übertragen werden. Es wird vermutet, dass die Signalübertragung durch Rezeptoroligomerisierung vermittelt wird. Ein Aktivierungsmechanismus durch Dimerisierung von RAGE stimmt mit der Anordnung der V-C1-Moleküle im Kristall überein, wo zwei Moleküle seitlich aneinander angeordnet sind. Aufgrund dieser Wechselwirkung von zwei V-C1-Molekülen im Kristall wurden surface plasmon resonance Experimente durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine ausgeprägte Wechselwirkung zwischen zwei V-C1-Molekülen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird folgendes Aktivierungsmodell für RAGE vorgeschlagen: Ligandenbindung an RAGE stabilisiert einen dimeren oder höher multimeren Zustand des Rezeptors. Dadurch nähern sich die zytosolischen Domänen einander an, und induzieren die Bildung einer Signalplattform, die die intrazellulären Signalkaskaden aktivieren kann.</dcterms:abstract>
<dcterms:isPartOf rdf:resource="https://kops.uni-konstanz.de/server/rdf/resource/123456789/28"/>
<dc:language>eng</dc:language>
<dcterms:alternative>Strukturelle Studien über Signalproteine: Regulierung des EF-Hand-Proteins S100A2 und Aktivierung des Receptor for Advanced Glycation Endproducts</dcterms:alternative>
</rdf:Description>
</rdf:RDF>Interner Vermerk
xmlui.Submission.submit.DescribeStep.inputForms.label.kops_note_fromSubmitter
Prüfungsdatum der Dissertation
November 6, 2007
