Bakterienstämme von Bakterienarten wie z.B. Mycobacterium tuberculosis oder Staphylococcus aureus, die lebensbedrohende Krankheiten verursachen, sind häufig gegen alle verfügbaren Antibiotika resistent geworden . Gegen Vacomycinresistente S. aureus Stämme, als Beispiel, wirkt keine der im Mark verfügbaren Antibiotika . Staphylococcus aureus ist das am häufigsten vorkommende Gram-positive Pathogen in der Intensivmedizin. Die Folgen solch einer bakteriellen Infektion, wie Sepsis oder septischer Schock, sind für 40%-60% der Patienten tödlich. Ein Drittel der Weltbevölkerung ist bereits mit dem Mycobakterium tuberculosis infiziert, welches für 3 Millionen Tote und 8 Millionen Neuinfektionen weltweit pro Jahr verantwortlich ist .
Um Ansatzpunkte für alternative Therapien und die Entwicklung neuartiger Medikamente zu erlangen, ist es unabdingbar, mit Hilfe von geeigneten synthetischen Substanzen zu erforschen, welche genauen molekularen Strukturen für eine Immun- bzw. Zellantwort verantwortlich sind. Um diesen Anforderungen Rechnung zu tragen, wurden in dieser Dissertation immunstimulatorisch wirksame Substanzen von Bakterienzellwandkomponenten Gram-positiver Bakterien wie Lipoteichonsäuren synthetisiert. Diese strukturell komplexen Verbindungen fungieren als zentrale Schaltstellen, die extrazelluläre Signale in intrazelluläre Anweisungen transformieren. Jene für die Gram-positiven Bakterien enorm essentiellen Verbindungen lösen sich beim Wachstum bzw. deren Zerstörung aus der Membran und werden in das extrazelluläre Medium freigesetzt. Rezeptoren des Immunsystems erkennen diese Strukturen und leiten daraufhin sofort eine Abwehrreaktion ein.
Als zentrale Bausteine für den sukzessiven Aufbau des Backbones wurden zunächst die Monoglyceroleinheiten 14, 15 und 19 aus -Isopropyliden-sn-glycerol dargestellt. Durch repetitives Zusammenfügen dieser Bausteine konnten mit Hilfe der Phosphitamidmethode die geschützten Oligoglycerolstrukturen verwirklicht werden. Das Auftreten von 2n (n = 1-5) Diastereomeren, bedingt durch die Verwendung von Phosphorsäuretriestern, erschwerte die Handhabung und Analyse der Verbindungen erheblich.
Die Kupplungen der Backbone (21, 23, 25 und 27) mit dem aktivierten Gentiobiosyl-Building-Block 13 führten in gute Ausbeute zu der gewünschte vollständige geschützte Oligoglycerolphospho-gentiobiosylsequenz (30, 34, 38 und 42), die nach Deblockierung der sekundären Hydroxyfunktionen letztendlich mit PyBOP und Cbz-D-Alanin vollständig verestert werden konnte. Die Freisetzung der Benzylschutzgruppen gelang unter Verwendung der schon erfolgreich erprobten Entschützungsbedingungen mittels Pearlman-Katalysator. Die myristoylgeankerte LTA-Struktur konnte mit Hilfe der Hydrophoben Interaktionschromatographie gereinigt sowie MS- und NMR- spektroskopisch charakterisiert werden. Die Realisierbarkeit der eingeschlagenen Schutzgruppenstrategie wurde so mit der geglückten Synthese der entschütztene D-Ala-LTAs (33, 37, 41 und 45) bestätigt, die bei sechs Glycerolphosphateinheiten die gleiche prozentuale Substituentenverteilung wie die LTA bakteriellen Ursprungs hat. Aufgrund des analogen Wirkverhaltens der synthetischen LTA gegenüber der nativen LTA konnte definitiv der Beweis erbracht werden, dass LTA biologische Aktivität besitzt.
Die erfolgreiche Synthese der LTAs (33, 37, 41 und 45) und die gleiche potente immunstimulatorische Wirksamkeit der Substanz in Bezug auf TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 und IL-10 wie das natürliche Substrat legte den Grundstein für weitere LTA-Analoga-Synthesen,
In vorhergehenden Arbeiten unserer Gruppe49,50 wurde bereits bewiesen, dass die Gentiobioserest keine entscheidende Rolle in der Aktivierung der Cytokinfreigabe im menschlichen Blut spielte. Dies stellt eine wichtige Handlungsanweisung zur synthese von Analoge mit vereinfachten Struktur dar. Bekannt war auch, dass die D-Alanin Esterbindung in diesen Moleküle über pH=8.5 instabil ist. Folglich war auch Ziel dieser Arbeit eine vereinfachte LTA-analog zu synthetisieren, wo die D-Alanin Esterbindung durch eine Amidbindung ersetzt wurde. Darum wurde Dipeptid 46 über eine typische Peptidkopplung synthetisiert und nach mehreren Umsetzungen wurde das Phosphoramidit 51 hergestellt. (Schema 42). Durch einen ähnlichen Reaktionszyklus wie oben beschrieben wurde die geschützte Verbindung 60 erhalten, die nach der Entschützung zur LTA-analog 63 hinführte. Der Unterschied zur vorherige Synthesestrategie war, dass das D-Alanin sehr früh in die Synthese eingeführt werden konnte, weil die Amidbindung stabil genug unter den Bedingungen war, die verwendet wurden, um das Backbone aufzuwachsen. Auch diese Verbindung wies immunstimulatorische Wirksamkeit auf, was das Beweiß dafür ist, dass der Sauerstoff nicht essenziell für die Wirkung ist. Damit ist der Weg offen für die Entwicklung stabilerer LTA-analoge.hema 47) erhalten.

All the glycerol moieties used in this work, 14, 15 and 19, were obtained from 1,2-O-isopropylidene-sn-glycerol49. Using the phosphoramidite approach were obtained the different backbone fragments. Starting with the reaction between 14 and 19, with tetrazole as catalyst and tBuOOH as oxidant agent, could be obtained the fragment with n=1 (20) (Scheme 40).
Desilylation and successive repetitions of this process yielded the different fragments 21, 23, 25, 27. These fragments were a 2n complex mixture of diasteromers, due to the chirality of the triesterphosphate which disappears only after the final deprotection. This mixture complicated any monitoring and purification of the reactions, due to the large number of spots.
The reaction of the fragments with the gentiobiose phosphite 13 yielded, in good yields, the protected fragments with the desired sequence of glycerophosphate backbones 30, 34, 38 and 42.
The removal of the p-methoxybenzyl protection was a problematic reaction in our previous work50. Reducing the equivalents of CAN and performing the reaction at -10° the yields were increased in more that 20% (31, 35, 39, 43), making this process optimal taking into account the complexity of the starting materials. After this deprotection was performed the introduction of Cbz-D-Ala residues using PyBOP as activating reagent (32, 36, 40, 44). In every case all the positions could be successfully esterified, obtaining in that way the protected fragments. The final deprotection was performed with Pearlman catalyst in a mixture of MeOH/DCM/H2O (33, 37, 41, 45) (Scheme 41). All this LTA fragments were purified using hydrophobic interactions chromatography, using octyl-sepharose as stationary phase and a gradient of isopropanol as eluent. The confirmation of the structures was achieved with help of MALDI-TOF and NMR techniques.
It was known already the poor stability of the D-Alanine ester bond over pH=8.5 in this type of molecules. Therefore it was also synthesized a compound with the D-Alanine residues linked through an amide bond to the backbone, but more changes were introduced to this analogue. The stereochemistry at position 2 of the glycerol moiety was inverted.
Dipeptide 46 was obtained via a typical peptide coupling and after some transformations was obtained the phosphoramidite 51. (Scheme 42)
The ending residue in this case was the same as used before for the fragments, the 2,3-dibenzyl-sn-glycerol 14. The couplings strategy was identical as for the previous compounds
The difference in this case was that the D-alanine was introduced since the very beginning, because the amide bond was stable enough under the conditions used to grow up the backbone. Using a similar reaction cycle as for the previous case was obtained the protected backbone 60. In previous work34,50 was already demonstrated that the gentiobiose moiety didn t play a decisive role in the activation of cytokine release in human blood, therefore in this analogue the diacyl glycerol lipid anchor is directly linked to the backbone.
The backbone fragment 61 reacted with the phosphoramidite 15 in presence of tetrazole as catalyst and tBuOOH as oxidant to give the protected analogue 62. Using the same strategy as in the previous case, the final deprotection was achieved with Pearlman catalyst, and after HIC the pure S. aureus analogue 63 was obtained. Again with help of MALDI-TOF and NMR techniques was confirmed the structure of the molecule.
All five final compounds obtained were biologically tested in order to know the activation of cytokine release in human blood. All these compounds demonstrated to be active and all of the in the same order, even when in some cases when the concentration was increased the activity decreased due to the micelles formation.
With these results we could conclude that a backbone with 2 D-Alanie residue was able to activate the immunosystem in terms of cytokine release in human blood. Also a conclusion was the fact that the stereochemistry at position 2 of the glycerol backbone is not decisive for the activation of the immunosystem. The change of D-Alanine ester bond through an amide bond resulted also in no effect in terms of biological activity.
The synthesis started with the obtaining of the protected building blocks. The D-ribitol moiety was synthesized in 6 steps following a reported procedure65. The two D-galactosamine residue s started with identical routes until compound 71, were the routes divided to obtain the donor 76 and the acceptor 79 through several protecting groups modifications.