Calcineurin B in Dictyostelium discoideum
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The genome of Dictyostelium discoideum contains a single gene (cnb1) for the regulatory (B) subunit of the Ca2+/calmodulin dependent protein phosphatase, calcineurin. Two mRNA species and two protein products differing in size were found. The apparent molecular masses of the protein isoforms corresponded to translation products starting from the first and second AUG codons of the primary transcript, respectively. The smaller mRNA and protein isoforms accumulated during early differentiation of the cells. Whereas the amount of the higher Mr protein isoform remained constant throughout development, the larger mRNA disappeared to virtually undetectable levels during aggregation. 5´RACE amplification of the smaller transcript yielded cDNAs lacking the 5´ nontranslated region and the first ATG initiator codon. Expression of truncated cDNAs and various chimeric genes encoding CNB-green fluorescent protein fusions in Dictyostelium indicate that the mature cnb1 transcript is processed by an unconventional mechanism that leads to truncation of the 5´ untranslated region and at least the first AUG initiator codon and to utilization of the second AUG codon for translation initiation of the small CNB isoform. Determinants for this processing mechanism reside within the coding region of the cnb1 gene.
A truncated CNB cDNA fragment was recombinantly expressed in E. coli and purified. The purified protein was used for the production of polyclonal antibodies and for the biochemical studies. The biochemical datas optained are very similar to datas described for CN from other organisms. It was shown, that the recombinant CNB binds to CNA from Dictyostelium and that it increases the phosphatase activity of CNA using the RII peptide as a substrate but not when using pNPP.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Diese Arbeit beschreibt die Isolierung des Gens für die regulatorische Untereinheit der Ca2+/Calmodulin abhängigen Proteinphosphatase (Calcineurin B, CNB) aus Dictyostelium discoideum sowie seine Charakterisierung auf molekularer und biochemischer Ebene. Ein Gen (cnb1), aber zwei entwicklungsregulierte mRNA Isoformen (cnb1S und cnb1L) von ca. 700 und 1000 Basen wurden in Dictyostelium Ax2 Zellen nachgewiesen. Die Expression der cnb1L mRNA Isoform nahm im Verlauf der Differenzierung ab und war ab dem Beginn der Aggregation nach ca. 6 h Entwicklungszeit und der Ausbildung fester Aggregate nach ca. 12 h nicht detektierbar. Die cnb1S mRNA Isoform zeigte ein gegenläufiges Expressionsprofil. Zwei Proteinisoformen von 18 (CNBS) und 20.5 kDa (CNBL) wurden auf einem Westernblot detektiert. Die Menge der CNBL Isoform blieb konstant über die gesamte Entwicklung hinweg auf demselben hohen Niveau wie in vegetativen Zellen. Die Expression der CNBS Isoform nahm mit dem Beginn der Aggregation stark zu und blieb dann ebenfalls auf diesem hohen Niveau. Die kompletten cDNA Isoformen wurden mit Hilfe des 5 RACE Systems isoliert. Die Sequenzanalyse ergab, dass der cnb1S cDNA im Vergleich zur cnb1L cDNA lediglich die 5 nicht-translatierte Region sowie mindestens das erste ATG Kodon fehlte. Die Expression von verkürzten cnb1L cDNAs sowie cnb1L-'green-fluorescent protein' Fusions-cDNAs ergab, dass die reife cnb1L mRNA durch einen bisher unbeschriebenen Mechanismus prozessiert wird, bei dem dem die 5 nicht-translatierte Region sowie mindestens das erste AUG Kodon entfernt wird. Bei dem Produkt handelt es sich um die reife und funktionelle cnb1S mRNA.
Ein CNB cDNA Fragment wurde rekombinant in E. coli exprimiert und gereinigt. Das Protein wurde für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern verwendet und biochemisch charakterisiert.
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ISO 690
AICHEM, Annette, 2000. Calcineurin B in Dictyostelium discoideum [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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