Die Erbinformationen aller Lebewesen sind in Form von Genen festgehalten. Die Weitergabe dieses Erbguts von einer Generation zur nächsten ist die Lebensbasis aller Organismen. Dafür ist ein Set von verschiedenen Enzymen notwendig, unter denen die DNA-Polymerasen eine Schlüsselrolle einnehmen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Substratakzeptanz von DNA-Polymerasen untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit wurden die sterischen Zwänge am aktiven Zentrum unterschiedlicher DNA-Polymerasen analysiert. Sowohl der Einbau von Nukleotiden als auch die anschließende Verlängerung wurden mithilfe chemisch modifizierter Sonden untersucht. Schon in früheren Arbeiten von Marx, Summerer und Strerath wurde festgestellt, dass Nukleosidtriphosphate, die eine Alkylgruppe an der 4 -C-Position der Desoxyriboseeinheit tragen, als Sonde eingesetzt werden können, um die Rigidität der aktiven Zentren von DNA-Polymerasen zu untersuchen. In dieser Studie wurden kinetische Untersuchungen der humanen DNA-Polymerase beta (Pol beta) und des Klenow Fragments der E. coli DNA-Polymerase I (KF(exo-)) durchgeführt, die deutliche Unterschiede in den sterischen Einschränkungen zeigten, die beim Zucker-Rückgrat des eingehenden Nukleotides und des 3´-Primerterminus wirken. Beide Enzyme wurden durch die Modifikation am eintretenden Nukleotid beeinträchtigt, allerdings zeigte die Pol beta einen stärkeren Effekt als das KF(exo-). Da die Pol beta eine ca. 10-fach geringere Genauigkeit in der Inkorporation von Nukleotiden im Vergleich zum KF(exo-) besitzt, würde man nach der Theorie der "active site tightness" eine rigidere Bindungstasche beim KF(exo-) als bei der Pol beta erwarten. Die Tatsache, dass das KF(exo-) die modifizierten Nukleotide besser einbauen konnte als die Pol beta, weist auf eine größere Flexibilität im aktiven Zentrum hin, zumindest in der Interaktion mit dem Zucker. Bei der Untersuchung der Interaktionen am 3´-Primerterminus konnten Unterschiede in der Verlängerungseffizienz der alkylierten Primer festgestellt werden, die um mehrere Größenordnungen variierten. Die beiden untersuchten Enzyme zeigten ein entgegengesetztes Verhalten, als sie die eingesetzten sterischen Sonden am Primerterminus im Vergleich zum eintretenden dNTP prozessierten. In der Tat konnte die Pol beta die Primer/Templat-Komplexe gut prozessieren, die am 3´-Primerterminus die Modifikation trugen. Die Enzymkonformation in der Pol beta konnte offensichtlich die Störung durch sterische Sonden besser tolerieren als die des KF(exo-). Dieser Teil der Arbeit bietet die ersten experimentellen Hinweise, dass bei den untersuchten Polymerasen unterschiedliche sterische Zwänge auf den Nukleotiden am 3´-Primerterminus wirken. Diese Erkenntnisse stimmen mit den experimentellen Daten über die Unterschiede in der "misalignment fidelity" überein. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die sterischen Zwänge direkt in der Genauigkeit von DNA-Polymerasen involviert sind.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Screeningsystem entwickelt, um eine Mutante der Pol beta zu finden, die eine erhöhte Überlesefunktion über DNA-Schäden vorweist. Das Ziel dieser Evolution war, einen Beitrag zur Klärung des Mechanismus zu leisten, der an der Basis der Bypass-Fähigkeit mancher DNA-Polymerasen liegt. Durch gerichtete Evolution und Screening einer randomisierten Bibliothek konnte eine Mutante isoliert werden, die eine verbesserte Überlesefunktion von abasischen Stellen zeigte. Die isolierte Mutante, 5P20 benannt, wurde anschließend biochemisch charakterisiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass diese Mutante die Verlängerung nach dem Einbau gegenüber einer abasischen Stelle 160-fach besser im Vergleich zum Wildtyp durchführen konnte.
Die Analyse der Sequenz dieser neuen Variante zeigte vier Mutationen. Durch die Untersuchung aller möglichen Kombinationen dieser vier Mutationen konnte gezeigt werden, dass zwei dieser Mutationen ausreichend für die Entstehung der neuen Eigenschaft waren und dass die weiteren beiden keinen negativen Einfluss darauf hatten.

The complete genetic information of every living being is retained within its genes. The transfer of the intact information to the next generation is the basis of life. A set of different enzymes is needed in the cell to copy and maintain intact this information and DNA polymerases play a key role in this task. The present work deals with the analysis of different aspects of substrate acceptance by DNA polymerases.
First, the steric constrains in the active site of DNA polymerases were analyzed, both during the incorporation and the elongation step using chemically modified probes. Marx, Summerer and Strerath could show in past works that nucleoside triphosphates bearing an alkyl group at the 4´-C-position on the deoxyribose moiety could be employed to analyze the rigidity of the active sites of DNA polymerases. In this work, kinetic studies of human DNA polymerase beta (Pol beta) and Klenow Fragment of E. coli DNA polymerase I (KF(exo-)) were carried out. Clear differences in the steric constraint, which act on the sugar backbone of the incoming nucleotide within the active site and the 3´-terminal primer nucleotide, could be shown. Both enzymes were affected by the modification at the incoming nucleotide, but the effects on Pol beta were significantly more pronounced. Pol beta exhibits about 10-fold lower nucleotide insertion fidelity than KF(exo-), therefore one would expect a more rigid nucleotide binding pocket in KF(exo-) than in Pol beta. The fact that KF(exo-) could incorporate the alkylated nucleotides better than Pol beta indicates a more flexible interaction of KF(exo-) with the sugar residue of the incoming nucleotide as compared to Pol beta.
The analysis of the interactions at the 3´-terminal primer nucleotide could demonstrate differences by many orders of magnitude in the elongation efficiency of the alkylated primers. The investigated enzymes showed opposite behaviors dealing with the alkylation at the 3´-terminal primer nucleotide or at the incoming nucleotide. Indeed Pol beta could elongate the size-augmented primers with a higher efficiency compared to KF(exo-). The enzyme conformation in Pol beta can probably tolerate this perturbation better than KF(exo-). This part of the work provides first experimental evidence that indeed varied steric constraints act on the 3´-terminal primer nucleotides in both DNA polymerases. These findings are in agreement with experimentally derived data concerning the differences in "misalignment fidelity". In conclusion, the results presented provide direct evidence for the involvement of considerably varied steric effects on fidelity among different DNA polymerases.
In the second part of this work a screening system was established for the detection of Pol beta mutants with better bypass properties over DNA damages. The goal was to get new insights for a better understanding of the mechanisms that lie at the basis of the acceptance of damaged substrates by DNA polymerases. By directed evolution and screening of a random library of mutants a variant could be isolated, which showed a better bypass over abasic sites. The isolated mutant, namely 5P20, was biochemically characterized. Kinetic studies could show that the mutant 5P20 could carry out the elongation after incorporation of a nucleotide opposite an abasic site 160-fold better as the wild type enzyme.
The analysis of the protein sequence confirmed four mutations. The investigation of all possible combinations of these four mutations demonstrated that merely two mutations were sufficient for the development of the new property, and that the further two had no influence on it.