Glucose and Glucokinase controlled mal gene expression in Escherichia coli.
MalT is the central transcriptional activator of all mal genes in Escherichia coli. It can be controlled (activated) by the inducer maltotriose, it can be inhibited by the interaction with certain proteins and its expression can be controlled. Here we report a novel aspect of mal gene regulation: the effect of cytoplasmic glucose and glucokinase on the activity of MalT as well as its expression. Amylomaltase is essential for the metabolism of maltose. It forms maltodextrins and glucose from maltose or maltodextrins in such a way that the number of glucosidic linkages stays constant. We found that glucose above a concentration of 0.1 mM blocked the activity of the enzyme. It is known that malQ mutants when grown in the absence of maltose or maltodextrins are endogenously induced by maltotriose that is derived from the degradation of glycogen. Therefore, the fact that glk malQ+ mutants showed elevated mal gene expression finds its explanation in the reduced ability to remove glucose from MalQ-catalyzed maltodextrin formation and is thus caused by the formation of a metabolically induced MalQ- phenotype. However, even in mutants lacking glycogen glucokinase controls endogenous induction. We found that overexpressed glucokinase due to its structural similarity with Mlc (the repressor of malT) competes at the level of PtsG with Mlc. In addition, even in mutants lacking Mlc (and glycogen) the overexpression of glk leads to a reduction in mal gene expression. This repression was dependent on the presence of either maltodextrin phosphorylase or amylomaltase and led to the inactivation of MalT.
Network regulation of sugar transport in Thermus thermophilus.
We report the presence of Mlc in a thermophilic bacterium. Mlc is known as a global regulator of sugar metabolism in gram-negative enteric bacteria that is controlled by sequestration to a glucose-transporting EIIBGlc of the phosphotransferase system (PTS). Since thermophilic bacteria do not possess PTS, Mlc in Thermus thermophilus must be differently controlled. DNA sequence alignments between Mlc from T. thermophilus (MlcTth) and Mlc from E. coli (MlcEco) revealed that MlcTth conserved five residues of the glucose binding motif of glucokinases. Here we show that MlcTth is not a glucokinase but is indeed able to bind glucose, unlike MlcEco. We found that mlc of T. thermophilus is the first gene within an operon encoding an ABC transporter for glucose, galactose and mannose, including a glucose/galactose/mannose-binding protein and two permeases. malK1, encoding the cognate ATP-hydrolyzing subunit, is located elsewhere on the chromosome. The system transports glucose at 70°C with a Km of 0.15 µM and a Vmax of 4.22 nmol per min per ml at an optical density (OD) of 1. MlcTth negatively regulates itself and the entire glucose/galactose/mannose ABC transport system operon but not malK1, with glucose acting as an inducer. MalK1 is shared with the ABC transporter for trehalose, maltose, sucrose, and palatinose (TMSP) and the ABC transporter for maltodextrins (MDX). Mutants lacking malK1 do not transport either glucose or maltose. The TMSP transporter is also able to transport glucose with a Km of 1.4 µM and a Vmax of 7.6 nmol per min per ml at an OD of 1, but it does not transport mannose.

Glukose und Glukokinase-kontrollierte mal Genexpression in Escherichia coli.
MalT ist der zentrale Transkriptionsaktivator aller mal-Gene in Escherichia coli. MalT wird einerseits durch den Induktor Maltotriose kontrolliert (aktiviert) und andererseits durch die Interaktion mit verschiedenen Proteinen inhibiert. Auch die Expression von MalT wird kontrolliert. Innerhalb dieser Arbeit wird ein neuer Aspekt der mal-Genregulation beschrieben: der Effekt den cytoplasmatische Glukose und das Enzym Glukokinase auf die Aktivität und die Expression von MalT ausüben. Amylomaltase, MalQ, ist essentiell für den Stoffwechsel von Maltose. MalQ bildet Maltodextrine und Glukose aus Maltose und Maltodextrinen. Bei dieser Transferreaktion bleibt die Anzahl der glykosidischen Bindungen konstant. Wir konnten zeigen, dass Glukose ab einer Konzentration von 0,1 mM die enzymatische Aktivität von MalQ hemmt. Es ist bekannt, dass malQ Mutanten endogen durch Maltotriose induziert werden, selbst wenn sie in Abwesenheit von Maltose oder Maltodextrinen im Medium wachsen. Diese Maltotriose stammt aus dem Abbau von Glykogen. Daher ist die Beobachtung, dass glk malQ+ Mutanten eine erhöhte mal-Genexpression aufweisen darauf zurückzuführen, dass Glukose nicht durch die Glukokinase aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt wird und die freie Glukose die Enzymaktivität von MalQ inhibiert, was zu einem MalQ- Phänotyp führt. Dennoch kontrolliert die Glukokinase selbst in Mutanten denen Glykogen fehlt noch die endogene Induktion. Wir konnten zeigen, dass überexprimierte Glukokinase durch die strukturelle Ähnlichkeit zu Mlc (dem Repressor von malT) auf dem Level von PtsG mit Mlc kompetitiert und somit die Expression von malT beeinflusst. Zusätzlich dazu konnte gezeigt werden, dass die Glukokinase in Abhängigkeit von MalQ oder MalP (Maltodextrin Phosphorylase) die Aktivität von MalT beeinflusst.
Netzwerkregulation des Zuckertransports in Thermus thermophilus.
Mlc ist aus Gram-negativen Bakterien als globaler Regulator des Zuckerstoffwechsels bekannt. Kontrolliert wird Mlc durch die Sequestrierung an die EIIBGlc Domäne des für Glukose spezifischen Phosphotransferase Systems (PTS). Da Thermus thermophilus kein PTS besitzt, muss Mlc hier einer anderen Regulation unterliegen. Sequenzvergleiche zwischen Mlc von T. thermophilus (MlcTth) und Mlc von E. coli (MlcEco) ergaben, dass MlcTth fünf konservierte Reste aus dem Glukose-Bindmotiv von Glukokinasen aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass MlcTth keine Glukokinase ist, aber im Gegensatz zu MlcEco dennoch in der Lage ist, Glukose zu binden. Mlc von T. thermophilus ist das erste Gen in einem Operon, das für einen ABC-Transporter für Glukose, Galaktose und Mannose bestehend aus einem Bindeprotein und zwei Permeasen kodiert. MalK1, das Gen welches für die dazugehörige ATPase-Untereinheit kodiert ist an einer anderen Stelle auf dem Chromosom lokalisiert. Das System transportiert Glukose bei 70°C mit einer Km von 0,15 µM und einer Vmax von 4,22 nmol pro min pro ml Zellen der OD1. MlcTth reprimiert sein eigenes Gen ebenso wie die Gene des Glukose/Galaktose/Mannose ABC-Transporters, nicht aber malK1. Glukose wirkt hierbei als Induktor. Die ATPase-Untereinheit MalK1 ist außerdem noch für das Trehalose, Maltose, Sucrose und Palatinose ABC-System (TMSP) und das Maltodextrin ABC-System (MDX) zuständig. Mutanten denen MalK1 fehlt transportieren weder Glukose noch Maltose. Das TMSP System kann auch Glukose mit einer Km von 1,4 µM und einer Vmax von 7,6 nmol pro min pro ml Zellen einer OD1 transportieren, nicht aber Mannose.