Poly(ADP-ribosyl)ation is a posttranslational modification of cellular proteins, which is mainly catalyzed by poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) by using NAD+ as substrate. The catalytic activity of PARP1 is known to be triggered by the binding of PARP1 to broken DNA via its two aminoterminal zinc finger motifs. DNA strand break-induced poly(ADP-ribosyl)ation is linked to DNA repair and maintenance of genomic stability.
Up to now, little information exists on the biological consequences of an enhanced poly(ADP-ribosyl)ation response.
The aim of the PhD project was to identify compounds that are able to enhance cellular poly(ADP-ribosyl)ation and to investigate if enhanced cellular poly(ADPribosyl)ation improves DNA repair and leads to higher genomic stability. To address these questions, two different approaches were used. The first one is to increase cellular PARP1 activity by supplementation of the nutritional factors zinc or nicotinic acid (NA) respectively; the second one is overexpression of human PARP1.
The determination of PARP1 activity as function of cellular zinc revealed a positive correlation between PARP1 activity and zinc status. To avoid the rapid decrease of the cellular NAD+ pool in PBMC, which was observed concomitant with polymer formation, cellular NAD+ pools were successfully replenished by ex-vivo supplementation of PBMC with the NAD+ precursor NA. NA supplementation led to substantially increased poly(ADP-ribose) formation after X-irradiation. In parallel cell survival was increased in NA supplemented PBMC when exposed to X-irradiation.
By contrast, overexpression of PARP1 resulted in reduced cell viability and a delay in DNA repair. However, frequency of micronuclei was reduced in PARP1-overexpressing cells, which indicates higher genomic stability.
Finally, since PARP1 acts as a catalytic dimer, with one molecule catalyzing automodification of the other, enzymatic studies were performed to determine the minimal fragment of PARP1, which can operate as a partner for automodification by wt-PARP1 and restores full enzymatic activity of wt-PARP1. Various fragments were cloned, expressed in E.coli and purified. In-vitro activity assays revealed, however that none of the PARP1 fragments generated was sufficient as an interaction partner for wt-PARP1 to reconstitute full activity of the enzyme.

Poly(ADP-ribosyl)ierung ist eine posttranslationale Modifikation zellulärer Proteine, welche, unter der Verwendung des Substrates NAD+, hauptsächlich durch die Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1 (PARP1) katalysiert wird. PARP1 wird durch die Bindung an DNA Strangbrüche über zwei aminoterminal gelegene Zinkfinger katalytisch aktiviert. Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung spielt unter anderem eine wichtige Rolle in der DNA Reparatur und dem Erhalt der genomischen Stabilität. Über die biologischen Konsequenzen einer erhöhten Poly(ADP-Ribosyl)ierung ist bis heute wenig bekannt.
Das Ziel dieser Doktorarbeit war es Substanzen zu identifizieren, welche die zelluläre Poly(ADP-Ribosyl)ierung verstärken, und zu untersuchen, ob die verstärkte Poly(ADP-Ribosyl)ierung zur Verbesserung der DNA Reparatur und zur Erhöhung der genomischen Stabilität beiträgt.
Zur Beantwortung dieser Frage kamen zwei unterschiedliche Ansätze zur Anwendung. Zum einen sollte die PARP1 Aktivität durch die Supplementation von Zink bzw. Nikotinsäure (NA) gesteigert werden, zum anderen durch die Überexpression von human PARP1.
Bei der Bestimmung der PARP1 Aktivität in Abhängigkeit der Zink Konzentration zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Aktivität von PARP1 und dem zellulären Zink-Status.
Um den schnellen Abbau des zellulären NAD+ Gehaltes, welcher mit der Bildung von Poly(ADP-Ribose) einhergeht, zu verhindern, wurde in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) das zelluläre NAD+ durch eine ex-vivo Supplementation des NAD+ Vorläufers Nikotinsäure (NA) ergänzt. Nach Bestrahlung zeigten die PBMC eine stark erhöhte Bildung von Poly(ADP-Ribose). Zudem war auch die Zellviabilität nach Bestrahlung in NA supplementierten Zellen signifikant erhöht.
Im Gegensatz dazu führte die Überexpression von PARP1 zu einer reduzierten Zellviabilität und einer verlangsamten DNA Reparatur. Die Bildung von Mikrokernen in den PARP1 überexprimerenden Zellen war hingegen erniedrigt, was auf eine Erhöhung der genomischen Stabilität hindeutet.
Da PARP1 als katalytisches Dimer aktiv ist, wobei ein Enzym das andere automodifiziert, wurden des Weiteren enzymatische Studien durchgeführt, die klären sollten, welches minimale PARP1 Fragment als Partner zur Automodifizierung durch Wt-PARP1 fungieren kann, und die volle Aktivität von Wt-PARP1 garantiert. Hierzu wurden diverse Fragmente kloniert, in E.coli exprimiert und aufgereinigt. In-vitro Assays zeigten, dass keines der generierten PARP1 Fragmente als Interaktionspartner ausreichend war, um eine volle Aktivität von Wt-PARP1 zu erlangen.