In der parasitischen Symbiose von biotroph pathogenen Pilzen mit ihren Wirtspflanzen spielen sehr wahrscheinlich Effektoren eine entscheidende Rolle. Es wird vermutet, dass sie der Unterdrückung der pflanzlichen Abwehrreaktionen dienen und mithelfen, den Wirtsstoffwechsel so umzusteuern, dass die Ernährung des Parasiten durch den Wirt gewährleistet ist.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Suche nach Effektoren im System Uromyces fabae auf Vicia faba. Effektoren sind bei sekretierten Proteinen besonders häufig. Da am Haustorium der Kontakt zwischen Pilz und Pflanze am engsten ist, ist hier ein Transfer der Effektoren ins pflanzliche Zytoplasma am wahrscheinlichsten.
Deshalb wurde mit Hilfe der Hefesignalsequenzfalle das haustorielle Sekretom von U. fabae untersucht. Dabei wurden 62 aus dem Haustorium sekretierte Proteine (Uf-HSPs) identifiziert. Zur Klärung der Stadienspezifität der Proteinsekretion wurde außerdem das Sekretom von in vitro Infektionsstrukturen im Haustorienmutterzellstadium untersucht. Dabei wurden 42 Uf-ISSPs (aus Infektionsstrukturen sekretierte Proteine) gefunden. Vier Proteine gehören sowohl den Uf-HSPs als auch den Uf-ISSPs an. Damit wurden insgesamt 100 sekretierte Proteine von U. fabae gefunden und gleichzeitig eine erhebliche Stadienspezifität der Sekretion beobachtet. Diese Stadienspezifität wurde durch reverse und Standard Northern Blots bestätigt.
Datenbankrecherchen mit Hilfe des BLAST Algorithmus, bei denen zu weniger als der Hälfte aller Proteine Sequenzähnlichkeiten gefunden werden konnten, von denen wiederum die meisten innerhalb der Uredinales angetroffen wurden, zeigten eine Spezifität der sekretierten Proteine für die Rostpilze beziehungsweise von vielen sogar für U. fabae. Dies wiederum weist auf eine durch Wettrüsten zwischen Pflanze und Parasit bedingte Koevolution und dadurch beschleunigte Evolution bei den Proteinen hin und ist ein starker Hinweis darauf, dass viele der gefundenen sekretierten Proteine Effektoren sein könnten. 20 Uf-HSPs also etwa ein Drittel des haustoriellen Sekretoms sind kurz oder cysteinreich oder beides, was auf eine Effektorfunktion im Apoplasten hinweist.
Mit Hilfe von internetbasierten Algorithmen wurde unter den Uf-HSPs, deren gesamte Sequenz bekannt war, Uf-RTP1 und vier Avirulenzproteinen (Avr) aus Melampsora lini, von denen ein Transfer in die Pflanzenzelle angenommen wird, nach gemeinsamen Sequenzmotiven gesucht. Dabei wurden zwar Motive gefunden, deren Verteilung über den Datensatz auf eine möglicherweise interessante Funktion hinweist, eine funktionelle Zuordnung dieser Motive, zum Beispiel zum Wirtszelltargeting, gelang jedoch nicht. Auch wurde der Datensatz auf die Häufigkeit der Targetingsignale RXLR und RXLXE/Q/D untersucht und festgestellt, dass die Häufigkeit von RXLXE/Q/D etwa der entspricht, die bei Oomyceten für RXLR erwartet werden würde. Das kann als Hinweis auf die Funktionalität gewertet werden. Einige Proteine wurden auch auf schon bekannte ELMs (eukaryotische lineare Motive) untersucht. Dabei wurden vor allem einfache Motive wie Phosphorylierungsstellen gefunden. Auch ein Motiv, das im Zusammenhang mit der Endozytose steht wurde mehrfach entdeckt, es konnte aber kein übermäßig starkes Vorkommen dieser Motive bei den Uf-HSPs festgestellt werden.
Ein Yeast Two Hybrid Screen gegen 153 putative Effektortargets aus verschiedenen Pflanzen zeigte eine große Zahl verschiedener Proteine, die an Uf-RTP1 binden. Für Uf-HSP42a wurde ein ähnliches Muster gefunden und daraufhin noch weitere Ähnlichkeiten zwischen den beiden Proteinen festgestellt.
Die immunfluoreszenzmikroskopische Lokalisierung einiger Uf-HSPs bestätigte deren Sekretion aus dem Haustorium. Die erhaltenen Lokalisierungen in der extrahaustoriellen Matrix beziehungsweise im pflanzlichen Zellkern können jedoch nicht als sicher gelten.
Diese Arbeit lieferte eine große Zahl von Effektorkanditaten, deren Funktion nun aufgeklärt werden kann. Für die zukünftige Auswahl von Kandidaten in den engeren Kreis der weiter zu untersuchenden Proteine sollte jedoch besser nicht mehr vorrangig die Lokalisierung im pflanzlichen Zytoplasma als Kriterium dienen sondern eher Auffälligkeiten beim Vergleich der Sekretome verschiedener Rostarten, das Vorhandensein von pflanzlichen Interaktionspartnern oder Phänotypen bei mit den Effektorkandidaten transformierten Wirts- oder Nichtwirtspflanzen.

Effectors play a crucial role in the parasitic symbiosis of biotrophic fungal pathogens with their respective host plants. Supposedly they serve the suppression of plant resistance responses and help to reprogram the host metabolism so that nutrition of the parasite is guaranteed.
This work describes the search for effectors in the system Uromyces fabae on Vicia faba. Effectors can be found among secreted proteins. Since the contact between fungus and plant is closest at the haustorium, transfer of effectors into the plant cytoplasm is most probable here.
Therefore, the yeast signal sequence trap was used to investigate the haustorial secretome of U. fabae. In doing so, 62 haustorially secreted proteins (Uf-HSPs) were identified. To clarify the stage specificity of protein secretion the secretome of in vitro infection structures in the haustorial mother cell stage was also analyzed. Thereby 42 Uf-ISSPs (infection structure secreted proteins) were found. Four proteins belong to the Uf-HSPs as well as the Uf-ISSPs. In total 100 secreted proteins of U. fabae were found and a strong stage specificity of protein secretion was observed. The stage specificity was corroborated by inverse and standard Northern blots.
Searches of databases using the BLAST algorithm yielded sequence similarities for less than half of these proteins. Of these similarities most were found among the Uredinales. This indicates a specificity of the secreted proteins for rust fungi or even U. fabae. This in turn suggests accelerated evolution. Accelerated evolution results from a coevolutionary arms race between plant and fungus and indicates that many of the secreted proteins that were found might be effectors. Also 20 of the Uf-HSPs were short or cysteine rich or both wich indicates effector function in the plant apoplast.
Using internet based algorithms those Uf-HSPs with complete sequence information, Uf RTP1, and four Avrs of Melampsora lini which supposedly are transferred into the plant cytoplasm were searched for common sequence motifs. Motifs were found and their distribution in the dataset seems to indicate interesting functions. On the other hand it was not possible to assign functions to these motifs, neither transfer to the host cytoplasm nor anything else. The dataset was also checked for the frequency of the motifs RXLR and RXLXE/Q/D. It was found that the frequency of the motif RXLXE/Q/D corresponds to that of RXLR among secreted proteins of Oomycetes. This could indicate the functionality of the motif. Some of the proteins were also checked for established ELMs (eukaryotic linear motifs). Here mainly simple motifs like phosphorylation signals were found. A motif involved in endocytosis was also detected. These motifs were not overrepresented among the Uf-HSPs however.
A yeast two hybrid screen against 153 putative effector targets from different plants did show a large number of proteins that bind to Uf-RTP1. A similar pattern was found for Uf HSP42a and following this other similarities between these two proteins were also detected.
The localization of some of the Uf-HSPs by immune fluorescence microscopy confirmed their secretion from the haustorium. The localizations in the extrahaustorial matrix and the plant cell nucleus that were obtained cannot be considered as definite however.
This work resulted in a large number of effector candidates the function of which can now be resolved. For the future choice of candidates to the more narrow range of proteins to be further investigated a new strategy should be used. The first criterion should no longer be the localization of the proteins in the plant cell cytoplasm. Conspicuities in the comparisons of the secretomes of different rusts, presence of interaction partners, or phenotypes in host or non host plants transformed with effector candidates, could serve as major choosing criteria instead.