Biochemische Untersuchungen zur Interaktion der aeroben sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase aus Escherichia coli mit der cytoplasmatischen Membran
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Zusammenfassung
Die aerobe sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpD) aus Escherichia coli ist ein lösliches Enzym, das in vivo durch die Bindung an die cytoplasmatische Membran aktiviert wird. Diese Arbeit beschreibt den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus der GlpD-Membran-Bindung.
Durch Kompetitionsstudien wurde gezeigt, dass die Bindung von GlpD an eukaryontisches Calmodulin die GlpD-Membran Bindung widerspiegelt. Mittels C-terminal verkürzter GlpD-Fragmente und mittels in-vitro-Mutagenese wurde die CaM-Bindedomäne von GlpD auf den Bereich von Aminosäuren 355-370, einer basisch amphiphilen alpha-Helix, eingegrenzt. Punktmutationen, die elektropositive Aminosäuren gegen elektronegative im hydrophilen Teil dieser Helix austauschen, beeinträchtigten die CaM-Bindung.
Direkte GlpD-Lipid Interaktion wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen demonstriert. Mithilfe der Monolayer-Technik wurde die penetrative Kraft von GlpD gegenüber unterschiedlich zusammengesetzten Phospholipid-Monolayern gemessen. Unter Verwendung von Phospholipid-Bilayern wurde in einem zweiten Ansatz nachgewiesen, dass GlpD an die Oberfläche von Liposomen bindet. Die Membraninsertion von GlpD war abhängig von der Lipidzusammensetzung: In Experimenten mit gemischten Phospholipiden wurde eine positive Korrelation zwischen dem Gehalt an negativ geladenen Phospholipiden und der induzierten Druckänderung beobachtet. Die Punktmutanten, die nicht mehr an Calmodulin banden, konnten bei physiologisch relevanten Drücken nicht mehr in Lipid-Monolayer inserieren. Experimente mit Lipid-Bilayern bestätigten, dass eine direkte GlpD-Lipid-Bindung besteht.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GlpD) from Escherichia coli is a peripheral membrane enzyme involved in respiratory electron transfer. For its enzymatic activity binding to the inner membrane is required. The way the enzyme interacts with the membrane and how this controls activity has not been elucidated. In this study, I provide evidence for direct protein-lipid interaction.
Characterizing the interaction between GlpD and eukaryotic calmodulin by using chemically distinct calmodulin antagonists I showed that only the amphiphilic bee venom compound melittin and negative charged phospholipids inhibited binding. GlpD mutant with deletion in the amphipathic alpha-helical domain spanning residues 355-370 failed to bind to calmodulin. Site-directed mutagenesis yielded GlpD mutants with alteration in the net charge of this helix and affected calmodulin binding. These data strongly suggest that binding of GlpD to calmodulin mimics association of GlpD with the cytoplasmic membrane.
Evidence for direct lipid-protein interaction was obtained using two different approaches, studies on lipid monolayers and on bilayer membranes. Using the monolayer technique, I observed insertion of GlpD into lipid monolayers with a clear preference for anionic phospholipids. Lipid monolayers, when used at sufficiently high surface pressure, mimic the lipid packing properties of biomembranes and are a reliable model system to study the mechanism how membrane-active proteins insert into cell membranes. The presented data reveal that GlpD penetrates lipid monolayer. The penetrative power of GlpD was strongly increased in the presence of anionic phospholipids. Mutants which failed to bind to calmodulin showed reduced ability to insert into lipid monolayers. Liposome binding experiments confirmed direct GlpD-lipid interaction.
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ISO 690
WALZ, Antje-Christine, 2001. Biochemische Untersuchungen zur Interaktion der aeroben sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase aus Escherichia coli mit der cytoplasmatischen Membran [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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