Mitochondrial DNA (mtDNA) is organized in protein-DNA macro-complexes, called nucleoids. Average nucleoids contain 2-8 mtDNA molecules, which are organized by the histone like mitochondrial transcription factor A. Besides well-characterized constituents, such as single-stranded binding protein or polymerase γ, various other proteins with illdefined functions have been identified.
We report for the first time that mammalian nucleoids contain essential enzymes of an integral antioxidant system. Intact nucleoids were isolated with sucrose density gradients from several tissues of different species as well as from several cell lines. Manganese superoxide dismutase (SOD2) was detected by Western blot in the nucleoid containing fractions. Since the mitochondrial matrix protein fumarate hydratase as well as malate dehydrogenase does not co-purify with the nucleoids it is unlikely that association of SOD2 with mtDNA is due to contamination of the nucleoid fraction. DNA, mitochondrial glutathione peroxidase, and polymerase γ were co-immunoprecipitated with SOD2 from nucleoid fractions, which suggests that an antioxidant system composed of SOD2 and glutathione peroxidase are integral constituents of nucleoids.
Using a sandwich filter-binding assay, direct association of SOD2 by salt-sensitive ionic forces with a chemically synthesized mtDNA fragment was demonstrated. Increasing salt concentrations during nucleoid isolation on sucrose density gradients disrupted the association of SOD2 with mitochondrial nucleoids and confirmed the involvement of ionic forces for the binding. Our biochemical data reveal that nucleoids contain an integral antioxidant system that may protect mtDNA from superoxide-based oxidative damage.
More important for the generation of oxidative DNA damage seems to be peroxynitrite which is generated by equimolar fluxes of superoxide and nitrogen monoxide. With a modified protocol for the fluorimetric analysis of DNA unwinding-assay significantly higher amounts of the highly mutagenic 8-oxo-7,8-dihydroguanine was found to be generated by peroxynitrite than by superoxide or hydrogen peroxide in a mtDNA model. Manganese superoxide dismutase was able to protect DNA from oxidative damage generated by equimolar fluxes of superoxide and nitrogen monoxide (resulting in peroxynitrite formation) in this model.

Die mitochondriale DNA (mtDNA) ist nicht wie oft beschrieben ein freies Molekül in der mitochondrialen Matrix, sondern ist innerhalb eines Protein-DNA-Komplexes organisiert, welcher als Nukleoid bezeichnet wird und aus 2-8 mtDNA Molekülen zusammengesetzt ist. Die Koordination des Aufbaus dieser Nukleoide wird dabei durch den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A gesteuert. Bis heute konnten etwa 30 Proteine als wichtige Bestandteile dieses Nukleoid-Komplexes identifiziert werden. Für einige der assoziierten Proteine ist eine definierte Funktion bekannt, so zum Beispiel für die Polymerase γ, das mitochondriale Einzelstrang-Bindeprotein (mtSSB) oder für die Helikase Twinkle. Vielen anderen Proteinen konnte jedoch bisher noch keine Funktion zugeordnet werden. Während dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Nukleoide, welche aus Säugetier-Gewebe oder -Zellen isoliert wurden, Proteine mit einer antioxidativen Funktion beinhalten. Die Isolation von intakten Nukleoiden erfolgte dabei mittels eines Saccharose-Dichtegradienten. Bei der Untersuchung der einzelnen Gradientenfraktionen wurde die Mangan Superoxide Dismutase (SOD2) in den Nukleoid enthaltenden Fraktionen identifiziert. Aufgrund verschiedener Kontrollen konnte ausgeschlossen werden, dass es sich hierbei um eine Kontamination dieser Fraktionen mit SOD2 handelt. Somit konnte SOD2 eindeutig als ein Protein identifiziert werden, welches mit dem Nukleoid-Komplex assoziiert ist. Co-Immunopräzipitations-Experimente bestätigten diesen Befund, und zusätzlich konnte sogar noch Glutathionperoxidase 1 als weiterer Bestandteil dieses Komplexes beschrieben werden. Die Assoziation der Glutathionperoxidase ist dabei von entscheidender Bedeutung, denn erst dadurch ist klar, dass Nukleoid-Komplexe ein intaktes Antioxidanzsystem beinhalten.
Während dieser Arbeit konnte weiter gezeigt werden, dass SOD2 in der Lage ist, direkt an mtDNA zu binden und hierzu keine weiteren Proteine notwendig sind. Aufgrund der Kochsalz-Abhängigkeit dieser Bindung ist klar, dass die Assoziation von SOD2 an die mtDNA aufgrund von ionischen Wechselwirkungen stattfindet. Die Kochsalz-Abhängigkeit wurde auch während der Nukleoid-Isolation beobachtet, da durch eine Erhöhung des Kochsalzanteils im Isolationspuffer neben SOD2 auch andere Proteine vom Nukleoid-Komplex abgelöst werden konnten.
Die Assoziation eines Antioxidanzsystems mit dem Nukleoid-Komplex spielt eine wichtige Rolle für den Schutz der mtDNA. Weniger bedeutend scheint dabei die von SOD2 und Glutathionperoxidase katalysierte Entgiftung von Superoxid und Wasserstoffperoxid zu sein im Gegensatz zum Abfangen von Superoxid und somit der Hemmung der Peroxynitrit-Bildung innerhalb der Mitochondrien. In einem Plasmid-DNA-Modell konnte gezeigt werden, dass Peroxinitrit in physiologischen Konzentrationen zur Bildung von signifikanten Mengen an 8-oxo-7,8-Dihydroguanin führt. Durch Zugabe von SOD2 konnte die Peroxynitrit-Bildung gehemmt und die 8-oxo-7,8-Dihydroguanin Bildung verhindert werden. Die Bildung von 8-oxo-7,8-Dihydroguanin durch Superoxid oder Wasserstoffperoxid konnte in weiteren Versuchen nicht beobachtet werden. Die genaue physiologische Bedeutung der Antioxidanzsystem-Assoziation ist noch unklar, es scheint aber, dass deren Hauptfunktion die Hemmung der Peroxinitrit-Bildung innerhalb der Mitochondrien ist und somit die mtDNA vor oxidativen Schäden schützt.
Hemmung oder Inaktivierung des Nukleoid assoziierten Antioxidanzsystems (z.B. durch Nitrierung der SOD2) führt somit zu einer erhöhten Peroxinitrit-Bildung und zu vermehrten oxidativen Schäden, welche dann besonders die mtDNA betreffen. Dies hat letztlich Mutationen in den Untereinheiten der Atmungsketten-Komplexe zur Folge, wodurch der oxidative Stress noch weiter verstärkt werden kann. Dieses Szenario, wie es unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen oder auch während des Alterns beobachtet wird, führt schließlich zur mitochondrialen Dysfunktion und zum Zelltod.