Staphylococcus aureus (S. aureus), a frequent human pathogen, often colonizes humans asymptomatically but can also establish severe infections of tissue or spread to the blood, leading to sepsis and sometimes death. Upon infection, the bacteria are recognized by specific immune receptors of the host able to bind to different molecular patterns of S. aureus, thereby inducing anti-bacterial responses, such as inflammation. Innate immune activation by S. aureus strongly depends on Toll like receptor (TLR) 2, which, beside other staphylococcal cell wall components, recognizes lipoteichoic acid (LTA), a major immunostimulatory molecule of all Gram positive bacteria. Despite the prominent role of LTA in S. aureus mediated immune activation, purified LTA selectively fails to initiate the release of IL 12 and subsequent IFNy in human whole blood. In contrast, stimulation of blood cells with whole S. aureus results in a strong IFNy release, suggesting further staphylococcal components to be responsible for its production. In the first part of this thesis, the IFNy inducing principle of S. aureus cell walls was characterized.
- Stimulation of human whole blood with staphylococcal cell wall preparations revealed that S. aureus triggers IFNy production in NK cells and T cells in a TNF and IL-12 dependent manner. IFNy release was found to be sensitive to phagocytosis inhibition and to treatment with enzymes digesting peptidoglycan (PGN), pointing to an important role of ingested PGN in S. aureus induced IFNy production. However, knock-out mice deficient in TLR2 or Nod2, both considered essential PGN receptors, did not show significantly altered IFNy release upon stimulation with S. aureus cell wall preparations. The experiments indicate that not S. aureus PGN itself represents a major IFNy inducing component but that it amplifies the recognition of PGN associated immunostimulatory molecules by mediating their intracellular uptake or presentation to the respective immune receptors.
Despite the pivotal role of LTA in S. aureus-mediated immune activation, soluble LTA has been described to be a weak inducer of inflammatory responses in vivo. Furthermore, soluble LTA released from the staphylococcal membrane was found to interact with human serum components, which might influence its recognition by innate immune receptors. In the second part of this PhD thesis LTA binding proteins were identified from human serum and their influence on LTA mediated cytokine secretion was investigated.
- SDS-PAGE profiles of human serum proteins, fractionated by gel chromatography in the presence or absence of S. aureus derived LTA, revealed interactions between LTA and different apolipoproteins. Among these apolipoproteins, significant inhibition of LTA-induced cytokine release was demonstrated for Apo B100 and could be mirrored by incubation of soluble LTA with human serum prior to stimulation of human blood cells.
Despite strong evidence that LTA represents a major immunostimulatory principle of Gram positive bacteria, recent reports suggested that not LTA but lipoproteins are dominant immunobiologically active structures of S. aureus and that the activity of purified LTA lies in contaminating lipoproteins. This was concluded from a 100 fold decreased immunostimulatory capacity of LTA preparations from mutant S. aureus lacking palmitate labeled lipoproteins (lgt) compared to LTA from the respective wild type strain (wt). In contrast, using the same bacterial strains and comparable experimental systems, i.e. human whole blood, we were able to demonstrate equipotent cytokine induction between lgt LTA and wt LTA. In order to find an explanation for these discrepancies in lgt LTA mediated immune activation, the specific requirements for lgt LTA recognition were investigated in the last part of this thesis.
- Cytokine induction by lgt LTA in human whole blood was critically dependent on LTA immobilization, phagocytic activity of blood cells and the presence of human serum, whereas wt LTA showed only an incomplete dependency. Furthermore, lgt LTA induced immune activation was strongly augmented by LTA specific IgG antibodies found to be present in human sera at varying levels. These results suggest a novel mechanism for lgt LTA mediated immune activation in human blood cells that involves opsonization dependent uptake of LTA enabling intracellular recognition and further explain why a previous study was unable to detect lgt LTA induced immune activation.

Staphylococcus aureus (S. aureus) ist eines der wichtigsten humanpathogenen Bakterien. Neben lokalen Entzündungen kann der Erreger schwere systemische Erkrankungen auslösen, bei denen sich die Bakterien über den Blutstrom verbreiten und die nicht selten einen tödlichen Verlauf nehmen. Im Verlauf einer Infektion werden charakteristische Merkmale der Bakterien von den Zellen des angeborenen Immunsystems über spezifische Rezeptoren erkannt. Dadurch wird eine Entzündungsreaktion ausgelöst, die letztlich das Absterben der Bakterien herbeiführt. In der Immunerkennung von S. aureus stellt Lipoteichonsäure (LTA) eine wesentliche immunstimulatorische Komponente dar, die neben weiteren Bestandteilen der Gram positiven Zellwand von Toll-like Rezeptor (TLR) 2 erkannt wird. Das immunstimulatorische Potenzial von S. aureus ist größtenteils auf LTA zurückzuführen, die in der Lage ist, die Immunzellen zur Freisetzung zahlreicher proinflammatorischer Zytokine zu stimulieren. Allerdings konnte gezeigt werden, dass lösliche LTA im Gegensatz zu ganzen S. aureus Bakterien keine IFNy; induzierende Aktivität aufweist. Dies deutet darauf hin, dass S. aureus neben LTA weitere immunstimulatorische Komponenten besitzt, die im Zuge einer Infektion für die Freisetzung von IFNy verantwortlich sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das IFNy induzierende Prinzip von S. aureus charakterisiert.
- Nach Stimulation von humanem Vollblut mit einem bakteriellen Zellwandlysat konnte gezeigt werde, dass IFNy von NK Zellen sowie T Zellen freigesetzt und durch die Monokine TNF und IL-12 initiiert wird. Durch Inhibition der Phagozytoseaktivität, sowie durch den enzymatischen Verdau des PGN Netzwerks konnte die IFNy Ausschüttung deutlich vermindert werden, was darauf hindeutet, dass durch die Aufnahme von PGN intrazelluläre Immunrezeptoren angesprochen werden. Da sowohl TLR2 als auch Nod2 als mögliche Rezeptoren für PGN diskutiert werden, wurde im folgenden die Rezeptorabgängigkeit des S. aureus Zellwandlysats mit Hilfe von TLR2-/- und Nod2-/- Mäusen untersucht. Allerdings konnte nach der Simulation mit S. aureus Zellwandlysat weder bei TLR2-/- noch Nod2-/- Mäusen eine Veränderung hinsichtlich der IFNy Freisetzung beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Sekretion von IFNy nicht durch PGN selbst induziert wird, sondern die Phagozytose und anschließende intrazelluläre Immunerkennung von weiteren Zellwand assoziierten Bakterienbestandteilen durch ein intaktes PGN-Netzwerk ermöglicht werden.
Obwohl LTA bereits als entscheidende immunstimulatorische Komponente der bakteriellen Zellwand identifiziert wurde, konnten mit löslicher LTA im Tiermodel bisher nur geringfügige Entzündungsreaktionen hervorgerufen werden. Da während einer Infektion mit Gram-positiven Bakterien LTA aus der Zellwand freigesetzt werden kann, besteht die Möglichkeit, dass Komponenten des humanen Serums mit löslicher LTA interagieren und dadurch ihre Immunerkennung beeinflussen. In zweiten Teil dieser Arbeit wurden LTA Bindeproteine aus humanem Serum identifiziert und deren Einfluss auf LTA-induzierte Zytokinfreisetzung untersucht.
- Vergleichende Analysen humaner Serumproben, die entweder mit oder ohne S. aureus LTA inkubiert wurden, konnten zeigen, dass lösliche LTA von verschiedenen Serum-Apolipoproteinen gebunden wird, wobei jedoch nur ein Apolipoprotein in der Lage war LTA-induzierte Zytokinfreisetzung in humanem Vollblut signifikant zu verringern. Dieser von Apo B100 hervorgerufene inhibitorische Effekt konnte ebenfalls durch autologes Serum nachgestellt werden, wenn dieses vor Stimulation der Blutzellen mit LTA zusammen inkubiert wurde.
Obwohl LTA generell als immunstimulatorisches Prinzip Gram-positiver Bakterien angesehen wird, wurden die immunstimulatorischen Eigenschaften der LTA kürzlich in Frage gestellt. Nachdem LTA einer S. aureus Mutante (dlgt), die aufgrund der Deletion des Gens für das Enzym „Lipoprotein Diacylglycerol Transferase“ keine Lipoproteine bildet, in einer Studie nur noch eine um 100fach verringerte Zytokinfreisetzung aufwies, wurde das immunstimulatorische Potenzial der Wildtyp-LTA Lipoprotein-Kontaminationen zugeschrieben. Im Gegensatz dazu konnte in unserem Labor gezeigt werden, dass dlgt LTA und wt LTA unter denselben experimentellen Bedingungen eine vergleichbare Zytokin-Antwort in humanem Vollblut induzieren. Um eine Erklärung für diese Widersprüche zu finden, wurden im letzten Teil dieser Arbeit die spezifischen Bedingungen für eine erfolgreiche Immunerkennung von dlgt LTA untersucht.
- Es konnte gezeigt werden, dass die Immunerkennung der dlgt LTA sowohl von der Immobilisierung der LTA an bestimmten Oberflächen, als auch von der Phagozytoseaktivität der Blutzellen abhängt. Darüber hinaus wurde dlgt LTA induzierte Zytokinfreisetzung durch LTA spezifische IgG Antikörper in humanem Serum verstärkt, wobei die Menge an freigesetzten Zytokinen mit dem Antikörpertiter des jeweiligen Blutspenders korrelierte. Diese Ergebnisse deuten auf einen neuen Mechanismus der LTA induzierten Immunaktivierung in humanem Vollblut hin. Ferner erklären sie, warum dlgt LTA in der vorangegangenen Studie nicht in der Lage war, eine Immunantwort auszulösen.