Die Ubiquitin Ligase E6AP (E6 assoziiertes Protein) stellt das Gründungsmitglied der Familie der HECT (homolog zum E6AP C-Terminus) Ubiquitin Ligasen dar. Das zugehörige Gen UBE3A befindet sich auf Chromosom 15 in der Region q11-13. Interessanterweise kann die Deregulation der E6AP Aktivität mit zwei völlig unterschiedlichen Krankheitsbildern beim Menschen assoziiert werden. Vermutlich stellt E6AP damit zurzeit das wichtigste Beispiel für die Tatsache dar, dass nicht physiologische Modulation des Ubiquitin Konjugationssystems zur Ausbildung von humanen Krankheitsbildern führen kann. So kann z.B. nicht physiologische Aktivierung von E6AP zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs beitragen, während Inaktivierung von E6AP kausativ zur Entstehung der schweren neurologischen Erkrankung Angelman Syndrom führt. Zusammen genommen bedeutet dies, dass eine genaue Charakterisierung der Signalwege an denen E6AP beteiligt ist, unumgänglich ist, da bis zum heutigen Tag hierzu sehr wenig bekannt ist. Deshalb sollte im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der E6AP Physiologie geleistet werden.
Während der experimentellen Arbeiten zu dieser wurde jedoch klar, dass die gängigen Säugerzellkultursysteme zur Überexpression oder für RNA Interferenz vermittelte Depletion von E6AP nicht hinreichend verwendbar waren. Der Grund hierfür war das unerwartete Ergebnis aus Zellkulturexperimenten, dass die ektopische Modulation von E6AP Proteinleveln hochgradig zytotoxisch war, so dass entweder Totalverlust der jeweiligen Kultur oder unzulängliche Expression von E6AP bzw. ineffizienter "knockdown" von E6AP beobachtet wurde. Aus diesen Gründen wurden neuartige Zellkultursystem entwickelt, bei denen die Überexpression bzw. der "knockdown" stringent an einen selektierbaren Marker gekoppelt wurde, so dass die üblichen Fallstricke umgangen werden konnten. Für die Überexpression konnte dies durch eine Ubiquitin-Fusionsstrategie erreicht werden, bei der die Antibiotikumsresistenz Puromycin N-Acetlytransferase an Ubiquitin, gefolgt von dem zu exprimierenden Protein fusioniert wurde. Hierbei wird die Tatsache ausgenutzt wird, dass Proteine, die an den C-Terminus von Ubiquitin fusioniert wurden, in Eukaryonten effizient durch zelleigene Ubiquitin spezifische Protease gespalten werden. Ergebnisse aus Experimenten, bei denen das beschrieben Konstrukt verwendet wurde, haben gezeigt, dass wie erwartet, jede transfizierte und Puromycin resistente Zelle das zu exprimierende Protein exprimierte. Eine ähnliche Strategie wurde verwendet um ein RNAi-basierte Knockdownsystem zu etablieren, dass die gleichen Eigenschaften zeigt, wie das Ubiquitin-Fusionssystem. Darüber hinaus wurden bei Systemen zu induzierbaren Systemen weiter entwickelt, die im Folgenden für diverse Fragestellungen verwendet wurden. Aus diesen Experimenten lies sich ableiten, dass die Deregulation von E6AP Expression in beide Richtungen zu drastischen zytotoxischen Effekten in Säugerzellen führt, welche sich nur durch Einstellen des normalen Expressionslevels von E6AP revertieren ließen. Darüber hinaus konnte durch Überexpressionsexperimente mit E6AP Mutanten gezeigt werden, dass der beobachtete zytotoxische Effekt von der Liagseaktivität von E6AP abhängt.
Die entwickelten Expressionssysteme wurden weiterführend vor allem dazu verwendet, die Einflüsse von E6AP Expression auf das zelluläre Proteom und Ubiquitom zu untersuchen. Ergänzt wurden diese Experimente durch klassische Affinitätsansätze, mit denen nach E6AP Interaktionspartnern gesucht wurde. Daten aus all diesen Experimenten lieferten drei Proteine, deren Funktion möglicherweise von E6AP beinflusst sein kann. Diese waren Herc2, Nesprin-2 und die schwere Kette des nicht-Muskle Myosins IIA (MYH9). Ein weiterführende Charakterisierung der Kandidaten ergab, dass es sich bei dem HECT Protein Herc2 um einen direkten Interaktionspartner von E6AP handelt, während sich keine Effekt durch E6AP auf MYH9 duch Co-Überexpressionsanalysen in Zellen nachweisen ließ und dies obwohl MYH9 in vitro sehr effizient von E6AP ubiquitiniert wurde. Ähnlich verhielt es sich für das 800 kD große Nesprin-2, ein Protein der Kernmembran. Auch hier konnte keine Interaction mit E6AP nachgewiesen werden. Überraschenderweise jedoch, führt die Überexpression einer inaktiven Mutante von E6AP zu einer quantitativen Relokalisierung von Nesprin-2 aus der Kernmembran hinaus ins Zytosol. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in Purkinje Neuronen von AS Mäusen, mit den verwendeten Methoden, kein Nesprin-2 in der Kernmembran detektiert werden kann während die Nesprin-2 Lokalisation in wild typischen Kontrollmäusen nicht verändert war. Außerdem konnte für E6AP, Herc2 und Nesprin-2 in humanen und murinen Embryonen eine überlappende Gewebeexpression gezeigt werden (Nebennierenmark, Testis u. spinale Neuronen).

The ubiquitin ligase E6AP (E6-associated protein) represents the founding member of the HECT (homologous to E6AP C terminus) family of E3 ubiquitin ligases. E6AP is encoded by the UBE3A gene located on chromosome 15q11-13. Intriguingly, deregulation of the E3 activity of E6-AP has been associated with two distinct human diseases, and, thus, E6-AP may currently represent the most prominent example for the notion that inappropriate modulation of the activity of components of the ubiquitin-conjugation system contributes to the development of human disease. Unscheduled activation of E6AP contributes to cervical carcinogenesis ('gain of function'), whereas inactivation results in a neurodevelopmental disorder, the Angelman syndrome (AS) ('loss of function'). Taken together, these facts necessitate the thorough elucidation of cellular pathways involving E6-AP.
During the course of this thesis, it became clear that available mammalian ectopic expression and RNA interference (RNAi) systems cannot be efficiently used to study E6AP function in mammalian cells. This is due the unexpected finding that modulation of E6AP expression levels is cytotoxic, resulting in rapid loss of either expression of E6AP or knockdown of E6AP expression in the respective cellular system. Thus, new systems were developed that overcome these pitfalls by stringently coupling the epression of overexpression constructs or knockdown constructs to a selectable marker. For overexpression, we made use of the ubiquitin-fusion protein approach and designed a eukaryotic expression construct encoding a fusion protein consisting of puromycin N-acetyltransferase fused to the N terminus of ubiquitin, which in turn is fused to the N terminus of a protein of interest. Results obtained with this system confirmed the predicted advantage of this expression construct, which is that any cell that is resistant to puromycin generates the protein of interest and the resistance marker protein in a 1:1 ratio, since puror and the protein of interest are not only expressed from the same transcript, but moreover are expressed as a polyprotein that is processed to the respective free proteins by ubiquitin specific proteases. A similar strategy was deployed to generate an RNAi-based knockdown system, for which the same features apply as for the ubiquitin-fusion approach. Namely, every transfected and selected cell shows the designated effect (overexpression or knockdown) on the respective protein of interest. Furthermore, inducible expression and knockdown systems were established. By using these systems, it became clear that deregulation of E6AP expression in either direction confers drastic cytotoxic effects, which so far could only be rescued by adjusting E6AP level back to normal. In addition, overexpression studies using mutant forms of E6AP, revealed that this cytotoxic effect depends on integrity and activity of E6AP (e.g. active full-length E6AP).
The expression systems developed, were used to address questions such as to how the cellular proteome or ubiquitome are affected by either overexpression of mutant variants of E6AP or depletion of E6AP mRNA by RNAi. In addition, classical affinity experiemts were performed to identifiy E6AP interaction partners. By combining data from all approaches, three proteins, Herc2, Nesprin-2, and the heavy chain of non-muscle myosin IIA (MYH9) were identified to be affected by E6AP in one way or another. However, the HECT domain containing protein Herc2 appears to be a direct interaction partner of E6AP, whereas for MYH9 though being a good substrate of E6AP in in vitro ubiquitylation assays no effect of E6AP expression could be observed by co-overexpression studies. Similarily, for the 800 kD nuclear membrane protein Nesprin-2 no direct interaction with E6AP could be shown. However, strikingly, Nesprin-2 can be efficiently relocated from the nuclear membrane to the cytosole by overexpression of an inactive mutant of E6AP. Furthermore, in Purkinje neurons from AS mice, Nesprin-2 seems to be completely absent from the nuclear membrane, as assessed by immunofluorescence and immunohistochemistry. Moreover, E6AP, Herc2, and Nesprin-2 show an overlapping tissue distribution in human and murine embryos (adrenal gland, testis, and spinal neurons).
In parallel to identification of proteins affected by E6AP expression, the question, if E6AP expression itself could be affected by microRNAs (miRNAs), was addressed, because in 10% of the AS patients the mechanism for E6AP inactivation is not clear and the miRNA pathway being one of the most important regulatory pathways for expression would be a good candidate for such mechanisms. Indeed, certain miRNAs, which are predicted to target the E6AP mRNA, have the potential to interfere with endogenous E6AP expression.