Biochemische und strukturbiologische Untersuchungen zur Substratbindung der extrazellulären PHB Depolymerase PhaZ7 aus Paucimonas lemoignei

Abstract

1. In dieser Arbeit wurden biochemische und strukturbiologische Untersuchungen an der extrazellulären PHB Depolymerase PhaZ7 aus Paucimonas lemoignei durchgeführt. Das Ziel ist die an der Substratbindung beteiligten Aminosäuren zu identifizieren. 2. Das PhaZ7 Protein wurde an dem C-terminalen Ende mit His6-Tag fusioniert, um die PhaZ7 Aufreinigung zu erleichtern. Dadurch konnte eine reproduzierbare Ausbeute von mindestens 3 mg PhaZ7chis6 Protein pro Liter Nährlösung erreicht werden. Die Reinheit des isolierten Proteins betrug über 99 %. Die Einführung des C-terminalen His6-Tags hatte keine signifikante Wirkung auf die Proteinexpression, Stabilität oder die spezifische nPHB Depolymerase Aktivität des PhaZ7chis6 Proteins. 3. Es wurde folgende PhaZ7chis6* Muteine konstruiert: Phe9Glu, Tyr66Glu, Tyr103Ala, Tyr103Glu, Tyr105Ala, Tyr105Phe, Tyr105Glu, Tyr124Glu, Tyr169Glu, Tyr172Ala, Tyr173Ser, Tyr176Glu, Tyr189Ala, Tyr189Glu, Tyr190Ala, Tyr190Glu, Phe198Glu, Tyr203Ser, Tyr204Ser, Trp207Glu, Phe251Glu, Trp252Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208. Nur die Aminosäurenaustausche an Tyr105, Tyr176, Tyr189, Tyr190, Trp207 und die Entfernung der Region Trp202-Val208 führten zu einer Veränderung in der Enzymkinetik im Vergleich zum Wildtyp PhaZ7chis6. 4. Das PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208 Mutein wurden mit einer Ausbeute von mindestens 7 mg Protein pro Mutein gereinigt. 5. Die in vitro nPHB Depolymerase Aktivitätstests mit gereinigtem PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208 Mutein zeigten eine Lag-Phase zu Beginn der Hydrolyse. Die spezifische Aktivität dieser Muteine mit Ausnahme des PhaZ7chis6* Trp207Glu Muteins lag unter 10 % der spezifischen Wildtyp Aktivität. Das PhaZ7chis6* Trp207Glu Mutein verfügte noch über 30 % der Wildtyp Aktivität. Die Lag-Phase am Anfang der Reaktion deutet auf eine Beeinträchtigung der Substratbindung hin. 6. Ein in vitro Bindungsassay für PhaZ7 an das natürliche Substrat (nPHB) wurde entwickelt. Für dieses Assay ist es zunächst notwendig, das PhaZ7 Protein aufgrund der sehr hohen nPHB Hydrolyseaktivität (6 x 106 U/mg) zu inaktivieren. Dies erfolgte durch die Mutation des Ser136 zu Alanin. 7. Für die PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu und DelTrp202-Val208 Muteine wurde eine inaktive Variante durch zusätzliche Ser136Ala Mutation konstruiert. Alle inaktiven Muteine wurden gereinigt. Die Ergebnisse der Bindungstests wiesen auf eine stark reduzierte nPHB-Bindung bei den oben genannten inaktiven PhaZ7chis6* Varianten auf. Die nPHB-Bindung des inaktiven Trp207Glu ist stärker als bei den restlichen Muteinen aber signifikant schwächer im Vergleich zum inaktiven Wildtyp. 8. Zusammen zeigen die Ergebnisse der nPHB Deolymerase Aktivitätstests und der Bindungstests eine Beteiligung von Tyr105, Tyr176, Tyr189, Tyr190, Trp207 und der Region Trp202-Val208 an der nPHB-Bindung. 9. Die Struktur des PhaZ7chis6 Wildtyps und der PhaZ7chis6* Muteine (Tyr105Ala, Tyr105Glu, Tyr190Glu und DelTrp202-208) wurde bereits mit einer Auflösung von 1,6 – 2 Å aufgeklärt. Eine bedeutende strukturelle Veränderung in der PhaZ7chis6* Muteinstruktur im Vergleich zu der Wildtyp Struktur wurde nicht gefunden. 10. Die Aufklärung der Struktur von PhaZ7chis6* Ser136Ala, welche an dem 3-HB Trimer gebunden ist, zeigte, dass das Trimer in einer Furche umgeben von Tyr105, Ser168, Tyr176, Pro182, Gln187, Asn188, Tyr189, Tyr190 und Phe195 gebunden ist. Die Strukturanalyse zeigte Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Trimer und dem Stickstoffatom in der Tyr189 Hauptkette bzw. in der Asn188 Seitenkette. Zu erkennen sind ferner die hydrophoben Wechselwirkungen des Trimers mit Tyr105, Tyr176 und Tyr190. Demzufolge wurde die Beteiligung der Tyr105, Tyr176, Tyr189 und Tyr190 an der Polymer Bindung bestätigt. 11. Die Struktur der freien PhaZ7chis6* Ser136Ala unterschied sich von der an das Trimer gebundenen Struktur. Die Hauptunterschiede bilden die Regionen 281-294 und 248-251. Die Region 281-294 ist in dem 3HB-Trimer-PhaZ7chis6* Ser136Ala Komplex nicht gelöst und deutet auf eine Beweglichkeit in dieser Region hin. Dies gilt als einen Hinweis für eine Konformationsänderung des Proteins nach der Substratbindung und unterstutzt die Hypothese dieser Arbeit.

1. In this study, the extracellular PHB depolymerase PhaZ7 from Paucimonas lemoignei was investigated on a biochemical and a structural level to identify amino acid residues involved in substrate binding. 2. A C-terminal His6 variant of PhaZ7 was constructed for simplified purification. A reproduceable yield of at least 3 mg PhaZ7chis6 protein per litre medium was achieved. The purity of the purified protein was > 99 %. The introduction of the his6-Tag has no significant effect on the protein expression, stability or specific nPHB depolymerase activity of the PhaZ7chis6 protein. 3. Following PhaZ7chis6* mutants were constructed: Phe9Glu, Tyr66Glu, Tyr103Ala, Tyr103Glu, Tyr105Ala, Tyr105Phe, Tyr105Glu, Tyr124Glu, Tyr169Glu, Tyr172Ala, Tyr173Ser, Tyr176Glu, Tyr189Ala, Tyr189Glu, Tyr190Ala, Tyr190Glu, Phe198Glu, Tyr203Ser, Tyr204Ser, Trp207Glu, Phe251Glu, Trp252Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu and DelTrp202-Val208. Only exchanges of Tyr105, Tyr176, Tyr189, Tyr190, Trp207 and deletion of Trp202-Val208 resulted in a change of its kinetic properties in comparison to the wild type protein. 4. The PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu and DelTrp202-Val208 mutants were purified. At least 7 mg protein per mutants was achieved. 5. In vitro nPHB depolymerase activity assays with purified proteins showed that Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu and DelTrp202-Val208 mutants hydrolyzed nPHB granules only after a lag phase of a few minutes at the beginning of the reaction. The specific nPHB depolymerase activity of these mutants with the exception of PhaZ7chis6* Trp207Glu mutant was under 10 % of wild type activity. The PhaZ7chis6* Trp207Glu mutant retained a specific activity of almost 31% of the wild type. The occurance of a lag phase at in vitro nPHB hydrolysis indicated a reduced substrate binding. 6. In vitro binding assays for PhaZ7 to its natural substrate (nPHB) were developed. Due to very high activity of PhaZ7 to nPHB (6 x 106 U/mg) it was nessesary to inactive PhaZ7 by an exchange of Ser136 to alanine. 7. An inactive variant of PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr176Glu, Tyr189Glu, Tyr190Glu, Trp207Glu, Tyr105Glu Tyr189Glu, Tyr105Glu Tyr190Glu and DelTrp202-Val208 mutants was contructed by an additional exchange of Ser136 to alanine. All inactive PhaZ7chis6* mutants were purified. The results of the binding assays with purified protein showed a reduced binding ability of these mutants to nPHB. The binding of PhaZ7chis6* Trp207Glu to nPHB was stronger compared to the remaining PhaZ7chis6* mutants. However, it was significantly weaker in comparison to the inactive wild type protein. 8. The results of nPHB depolymerase activity assay together with the results of the nPHB binding showed that Tyr105, Tyr176, Tyr189, Tyr190, Trp207 and the region 202-208 are crucial for nPHB binding indicating the involvement of these amino acid residues and region in polymer binding. 9. The protein structures of PhaZ7chis6* Tyr105Glu, Tyr190Glu and DelTrp202-Val208 were determined at 1.6 Å resolution and 2.0 Å resolution for the PhaZ7chis6* deletion mutant respectively. Structural analysis showed only slight differences in comparison to the wild type structure suggesting flexibility of some regions in PhaZ7. 10. Recently the structure of inactive PhaZ7chis6* Ser136Ala bound to a 3-HB trimer was solved at 1.6 Å resolution. The 3-HB trimer molecule was found to be bound at a surface cavity surrounded by Tyr105, Ser168, Tyr176, Pro182, Gln187, Asn188, Tyr189, Tyr190 and Phe195. Analysis of the structure revealed hydrogen bonds between the 3-HB trimer with the main-chain nitrogen of Tyr189 and the side-chain nitrogen of Asn188. Hydrophobic interactions were also observed between the trimer molecule and the aromatic rings of Tyr105, Tyr176 and Tyr190. This result confirms the involvement of Tyr105, Tyr176, Tyr189 and Tyr190 in the polymer binding. 11. The superposition of free and trimer-bound PhaZ7chis6* Ser136Ala exhibited that both structures were different from each other. The main changes were found in the 281-294 and 248-251 regions. The loop 281-294 could not be resolved in the 3-HB-trimer bound PhaZ7chis6* Ser136Ala structure, suggesting some flexibility of these regions. The fact that both structures, free PhaZ7 and the substrate bound PhaZ7 differ from each other supports our hypothesis that conformational changes in the PhaZ7 structure occur upon substrate binding.