Die humane Acetylcholinesterase: Design und Synthese eines optimierten Gens und die Expression in Pichia pastoris

Abstract

Ziel der Arbeit war die Etablierung eines Expressionssystems für die Herstellung funktioneller humaner Acetylcholinesterase. Aufgrund der bekannten negativen Erfahrungen mit anderen Expressionssystemen wurde als host Organismus P. pastoris gewählt. Um die Expression auf der Translationsebene weiter zu begünstigen wurde die Codon-usage des zu synthetisierenden Gens an die des Expressionsorganismus angepasst. Das synthetische Gen wurde für die Expression in P. pastoris in die Vektoren pPICZαA und pGAPZαA kloniert, die sich durch ihre Promotoren, den Methanol-induzierbaren AOX1-Promotor und den konstitutiven GAP-Promotor, unterscheiden. Zur schnellen Identifizierung von Transformanden, die das Gen in aktiver Form exprimieren wurde ein Agarplattenassay entwickelt. Zur weiteren Optimierung der Ausbeuten wurden der Einfluss verschiedener Medien, Fütterungsstrategien und Kultivierungsfaktoren wie des pHs des umgebenden Mediums untersucht. Unter den so erreichten optimierten Bedingungen konnte in Schüttelkolbenkulturen eine Expression von bis zu 10000 U/l erzielt werden. Ein Großteil dieser Ergebnisse konnten für die Optimierung einer Fermentation übernommen werden, in der schließlich entsprechende Expressionsraten erzielt wurden. In einen weiteren Schritt wurde der Einfluss der veränderten Nucleotidsequenz auf die Expression in P. pastoris und in COS-Zellen untersucht. Während in den Säugerzellen eine deutliche Abhängigkeit der Expression von der verwendeten Nucleotidsequenz festgestellt wurde, konnten in P. pastoris mit drei unterschiedlichen Genkonstrukten, die alle für die humane Acetylcholinesterase kodierten, keine unterschiedlichen Mengen an exprimiertem Protein festgestellt werden. Mit der Synthese einer optimierten Gensequenz, der Wahl von P. pastoris als Wirtsorganismus und der Etablierung eines Affinitätsaufreinigungs-Protokolls konnte ein effizientes Expressionssystem zur Produktion hochreiner humaner Acetylcholinesterase etabliert werden.

The aim of this thesis was to establish an effective expression system for the production of functional human acetylcholinesterase in good yields. As host organism the methylotrophic yeast Pichia pastoris was chosen, due to negative results with other expression systems.. To make expression on the translation level more effective the codon usage in the synthetic gene was adapted to the codon usage observed in highly expressed P. pastoris genes. The synthetic gene (PopthAChE) was cloned into the vectors pPICZαA and pGAPZαA, which are different in their promoter regions (methanol inducible AOX1-promotor or the constitutive GAP-promoter respectively). A new overlay agar assay was established make a fast identification of positive transformants feasible. To optimize protein yields the influence of culture media, feeding strategies and cultivation parameters as pH of the media were investigated. Under fully optimized conditions an expression of 10000 U/l was reached in shaking flask cultures. In part these optimization steps could be transferred to a fermentation process, in which finally corresponding results were achieved. In a further part the influence of the modified nucleotide sequence on the expression was investigated in P. pastoris and COS cells. While in the mammalian cell lines an strong dependence on the used nucleotide sequence was observed, the three different gene constructs (all encoding for the human acetylcholinesterase) yielded no different protein levels in P. pastoris. With the synthesis of an optimized gene sequence, the choice of the host P. pastoris and by establishing a purification method by affinity chromatographie an effective expression system for the production of high purity acetylcholinesterase was constituted.