Expressionshemmung des humanen Onkogens Bcr-Abl durch RNA-Interferenz

Abstract

Die Aktivität der Bcr-Abl-Tyrosinkinase (Bcr-Abl-TK) ist die molekulare Ursache für die Entwicklung der Chronisch Myeloischen Leukämie (CML). Bei der Akuten Lymphatischen Leukämie (ALL) bedeutet das Vorhandensein des Philadelphia-Chromosoms und damit die Expression des Bcr-Abl-Onkogens eine erhebliche Verschlechterung der klinischen Prognose. Da Bcr-Abl nur in den malignen Zellen präsent ist und darüber hinaus kausal zur Entstehung des leukämischen Phänotyps beiträgt, stellt es ein ideales Ziel für eine pharmakologische Inhibition dar. Seit 2001 ist ein effektiver Inhibitor der Bcr-Abl-TK-Aktivität (Imatinib mesylate, Glivec®, GleevecTM, Novartis, Schweiz) von der amerikanischen ‚Food and Drug Administration’ (FDA) für die Therapie Ph+-Leukämie-Patienten zugelassen. Trotz beeindruckender Resultate dieses Bcr-Abl-TK-Inhibitors bei der Behandlung von Leukämie-Patienten ist die Wirkung des Medikaments limitiert. So sprechen Patienten mit CML im fortgeschrittenen Stadium und Patienten mit Ph+-ALL im Allgemeinen schlecht auf eine Imatinib-Behandlung an, da es hier häufig zur Entwicklung von Resistenzen gegen den Inhibitor kommt. Um einem derartigen, durch Selektion therapieresistenter Zellklone verursachten Wirkungsverlust vorzubeugen, ist es notwendig, mehrere alternative Therapiestrategien zu kombinieren.

'RNA-Interferenz' (RNAi) beschreibt einen durch 'short interfering RNAs' (siRNA) ausgelösten, hoch konservierten Mechanismus zur sequenzspezifischen Stilllegung von Genen. Jüngste Fortschritte im Bereich der Anwendung von sequenzhomologen siRNA-Molekülen für die gezielte Inaktivierung von Genen in Säugerzellen wecken die Hoffnung auf eine klinische Nutzung dieser neuen Technik. Der Sequenzbereich an der Fusionsstelle der Abl- und Bcr-Sequenzen des Bcr-Abl-Fusionstranskripts ist charakteristisch für leukämische Zellen. Solche Fusionstranskripte, die für krankheitsspezifische Proteine codieren, stellen daher ideale Angriffspunkte für eine zielgerichtete 'antisense'-Strategie dar.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation gelang es am Beispiel des humanen Onkogens Bcr-Abl zu zeigen, dass es möglich ist, die Expression dieses chimären Gens durch in vitro-Applikation sequenzhomologer siRNA-Moleküle effektiv und hoch spezifisch zu hemmen. Auf Grund der hohen Stabilität des Bcr-Abl-Onkogenprodukts und der transienten Natur der RNAi in Säugerzellen erwies sich eine siRNA-Expositionsdauer von mind. 48 h als notwendig, um einen signifikanten anti-leukämischen Effekt zu erzielen. Diese verlängerte Exposition gelang zum einen durch wiederholte Transfektion von chemisch synthetisierten siRNAs oder durch stabile intrazelluläre siRNA-Expression unter Verwendung entsprechender Expressionsvektoren. Dieses optimierte siRNA-Behandlungsprotokoll bewirkte sowohl bei den humanen als auch bei den murinen hämatopoetischen Zelllinien eine Reduktion des Bcr-Abl-Proteinspiegels um bis zu 86%. Der Verlust der transformierenden Eigenschaften des Onkogens führte dabei in allen Fällen auch zu einem Rückgang der malignen Proliferation bzw. zum Absterben der behandelten Zellen.

Die im Rahmen dieser Dissertation gelungene Übertragung des in Bcr-Abl-transfizierten Zelllinien-Modellen entwickelten RNAi-Protokolls auf leukämische Ph+-Zellen lieferte einen ersten Hinweis auf eine Eignung der RNAi-Strategie auch für die klinische Anwendung. Interessant im Hinblick auf eine zukünftige klinische Anwendung dieser Technik ist außerdem die Beobachtung, dass mit Hilfe der Bcr-Abl-RNAi Bcr-Abl-positive Zellen gegenüber klinischen Therapie-Ansätzen, wie z.B. der Imatinib mesylate-Behandlung oder der gamma-Bestrahlung sensibilisiert werden konnten. In diesem Zusammenhang konnte weiterhin erstmalig gezeigt werden, dass durch diese Sensibilisierung auch verschiedenen zellulären Mechanismen einer Imatinib-Resistenz (z.B. Bcr-Abl-Überexpression und die Expression bestimmter Bcr-Abl-Mutationen) entgegengewirkt werden konnte.

Obwohl die effiziente Übertragung von siRNA-Molekülen in die 'Target'-Zellen in vivo noch einen großen Teil an Forschungsarbeit erfordern wird, zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass die Bcr-Abl-RNAi allein oder in Kombination mit anderen Therapieansätzen von therapeutischem Wert sein kann.

The discovery of the Philadelphia (Ph) chromosome represented the first consistent chromosomal abnormality causing a specific human cancer. The Ph chromosome is generated by a reciprocal translocation between the long arms of chromosome 9 and chromosome 22. It occurs in almost all patients with chronic myelogenous leukemia (CML) and in about 10-20% of the adults with acute lymphoblastic leukemia (ALL). The t(9;22) translocation fuses the Bcr gene from chromosome 22 and the Abl gene from chromosome 9, resulting in the oncogenic Bcr-Abl fusion gene. The presence of Bcr-Abl is assumed to be sufficient and necessary to initiate CML.

Imatinib mesylate (STI571, GleevecTM, Glivec®), a potent tyrosine kinase inhibitor has been recently approved by the american 'Food and Drug Administration' (FDA) for clinical treatment. Inhibition of the tyrosine kinase activity of Bcr-Abl by imatinib mesylate proved to be very effective for treatment of Ph+ leukemia patients. Nevertheless, both ALL and advanced CML patients frequently develop drug resistance after initial response, predominantly caused by genetic abnormalities such as point mutations leading to a single amino acid exchange in the Bcr-Abl kinase domain or overexpression of Bcr-Abl. Therefore the development of alternative strategies to inhibit Bcr-Abl becomes increasingly important.

RNA interference (RNAi) is a cellular mechanism that utilizes the ability of double-stranded RNA (dsRNA) to interfere with homologous gene expression at the RNA or DNA level. Recent developments in the use of siRNA to inhibit specific protein expression in mammalian cells have highlighted the potential use of these molecules as a therapeutic agent. The exact fusion site of the Bcr and Abl sequences on the Bcr-Abl mRNA represents a leukemia specific nucleotide sequence. Such fusion transcripts encoding disease specific proteins are ideal targets for a tumor-specific RNAi approach. The aim of the present study was to develop an optimized in vitro Bcr-Abl RNAi protocol. Therefore, several chemically synthesized asymmetric siRNAs, as well as stable expressed shRNAs targeting the fusion site of the clinically relevant Bcr-Abl transcript variants (e14a2, e13a2 or e1a2) were evaluated.

As a result of this work, it was possible to determine effective siRNAs, which led to significant downregulation of the Bcr-Abl fusion protein in Bcr-Abl expressing cell lines (32D-, M07-) as well as in Ph+ leukemic cell systems (K562 cells, MEG-01 cells and primary Ph+/CD34+-cells). Inactivation of Bcr-Abl caused a reversion of Bcr-Abl-dependent effects on cell cycle regulatory and antiapoptotic proteins resulting in a selective inhibition of cell growth. In addition, the results demonstrate that the biological phenotype of Bcr-Abl positive cells and their response to imatinib can be effectively modulated by breakpoint specific siRNAs. Accordingly, two major mechanisms of imatinib resistance: overexpression of the protein and a proportion of point mutations in the ATP binding site, are antagonized by decreasing the quantity of the Bcr-Abl protein using siRNA treatment.

It can be concluded that breakpoint specific siRNAs represent a promising principle for modulating transforming genes and should be further developed towards clinical application