Einfluss DNA-bindender Proteine auf die Hybridisierungsdynamik diagnostischer DNA-Mikroarrays

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Hybridisierungsdauer bei DNAMikroarrayexperimenten durch einen biochemischen Ansatz zu verringern. Dabei wurden Arrays mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern zur SNP-Detektion im β-Lactamasegen verwendet. Durch den Zusatz des Tumorsupressorproteins p53 sollte die Hybridisierung komplementärer Sonde und Probe beschleunigt werden. Von diesem Protein ist u.a bekannt, daß es einen Effekt auf die Hybridisierungskinetik von DNA-Einzelstränge in vivo und in vitro besitzt. Zur Kontrolle und Optimierung dieser p53-Aktivität wurden Hybridisierungsversuche mit fluoreszenzmarkiertem PCR-Produkt und einzelsträngigen Oligonukleotide durchgeführt. Der Nachweis von DNA-Einzel- bzw. Doppelsträngen erfolgte über deren unterschiedliches Laufverhalten in Acrylamidgelen (Band shift assay). Die Hybridisierungskinetik beider Ansätze konnte durch den Einsatz von p53 beschleunigt werden. Die in den Band shift Experimenten ermittelten Reaktionsbedingungen wurden nachfolgend auf Mikroarray-Versuche übertragen. Auch für dieses heterogene System mit festphasengebundener Sonden-DNA konnte eine Verkürzung der Hybridisierungsdauer mit p53 gezeigt werden. Bereits nach 30-minütiger Inkubation wurden deutliche Hybridisierungssignale nachgewiesen. Gegenüber Hybridisierungsversuchen mit reinem Puffer, ist dies ein deutlicher Zeitgewinn. Um den Bedarf an p53 nachfolgender Arrayexperimente decken zu können, wurden initiale Klonierungs- und Expressionsversuche in E.coli durchgeführt.

In this work the hybridization time of DNA-microarrayexperiments should be decreased by a biochemical approach. Therefore poly-L-lysine coated glass-slides for SNP-detection in the β-lactamasegene were used. Accelerated hybridization of DNA-probe with target should be achieved by the addition of the tumor supressor protein p53. This protein is known to have an effect on the hybridization kinetics of DNA-single strands in vivo and in vitro. To verify the p53-activity hybridization experiments with fluorescence labeled PCRproduct and single stranded oligonucleotides were performed. DNA-single and double strands were detected by their different migration in polyacrylamide gels (band shift assay). The hybridization kinetics for both approaches was accelerated by the use of p53. The experimental conditions of band shift experiments were transfered to microarray tests. The reduction of hybridization with p53 could also be shown in this heterogenous system with bound probe-DNA. Even after 30 min of incubation a clear hybridization signal could be detected. This was a clear shortening compared to attempts with pure buffer. To assure a continous supply of p53 for coming array experiments initial cloning and expression experiments in E.coli were performed.