Etablierung einer biologischen vaskularisierten Matrix als Grundlage für ein in-vitro-Lebertestsystem

Abstract

Die Leber spielt eine zentrale Rolle im Stoffwechsel eines Organismus. Sie ist aus einer Vielzahl hochspezialisierter Zellen aufgebaut und übernimmt komplexe, für den gesamten Organismus lebensnotwendige Stoffwechselfunktionen. Eingenommene Medikamente und Substanzen gelangen im Menschen über das Blutkreislaufsystem zur Leber und werden dort von den Hepatozyten um- und abgebaut (Biotransformation). Hierbei entstehen sogenannte Metabolite, die oft eine ganz andere (mitunter toxische) Wirkung haben als das ursprüngliche Medikament. Aus diesem Grund sind Leberzellen (Hepatozyten) bzw. das gesamte Organ "Leber" von besonderem Interesse als Analysesystem für Substanzen, Wirkstoffe und ihre Metabolite. Es gibt für Metabolismusstudien verschiedene, relativ einfache in vitro Testsysteme jedoch noch kein humanes organähnliches Lebermodell, das Langzeitstudien an primären Hepatozyten ohne Funktionsverlust ermöglicht. Damit isolierte Hepatozyten in der Kultur ihre Funktionalität behalten, ist die Bereitstellung einer möglichst in vivo ähnlichen Mikroumgebung wichtig. Dazu gehören einerseits die Co-Kultur mit nicht-parenchymalen Leberzellen und andererseits die Gewährleistung der Zellversorgung sowie eine geeignete Trägerstruktur (Matrix), die eine 3-Dimensionalität der Kultur schafft. Zur Aufbau eines Co-Kultursystems wurden in dieser Arbeit Endothelzellen eingesetzt, da sie eine Filtrationsbarriere für Makromoleküle zwischen dem Blut und den Gewebszellen bilden und an der Regenerationsprozessen beteiligt sind. Als Trägerstruktur wurde eine azellularisierte, vaskularisierte Matrix aus Schweinedarm, das so genannte "Biological Vascularized Scaffold" (BioVaSc), verwendet. Sie basiert auf einem 10 - 15 cm langen Stück porcinen Jejunums, welches sich unter Erhalt der Gefäßsystemstrukturen inklusive des arteriellen Zuflusses sowie des venösen Abflusses chemisch azellularisieren lässt. Eine ausreichende Versorgung der Hepatozyten mit Nährstoffen und Sauerstoff sowie der Abtransport von Toxinen und Metaboliten nach Medikamenten-/Wirkstoff-Umsetzung ließen sich durch ein computergesteuertes Bioreaktorsystem gewährleisten. Zum Aufbau eines Lebermoduls wurde die BioVaSc in zwei Schritten mit Zellen besiedelt: Im ersten Schritt erfolgte die Rebesiedelung der Gefäßstrukturen mit primären mikrovaskulären Endothelzellen oder endothelialen Vorläufer über den arteriellen Zufluss. Im zweiten Besiedlungsschritt folgte die Besiedlung des Matrixlumens (ehemaliger Darm) mit primären Hepatozyten. Dazu wurden die Zellen in einer Kollagen-I-Suspension ins Matrixlumen pipettiert und selbiges an beiden Seiten mit Klemmen verschlossen. Das so entstandene Co-Kultursystem ließ sich über einen Zeitraum von 2-3 Wochen im Bioreaktor kultivieren. Eine Probenentnahme zur Überwachung der Zellfunktionen erfolgte wochentäglich. Nach Versuchsende fand eine Fixierung der BioVaSc für die Herstellung von Paraffinpräparaten statt. Anhand der Expression der endothelzellspezifischen Marker CD 31 und FLK-1 konnte im Rahmen dieser Arbeit die Differenzierung porciner Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane Endothelzellen ließen sich unter Erhalt der genannten Marker in das Gefäßsystem integrieren und waren der Ursprung für neu entstandene Blutgefäße (Neoangiogenese). Die ins System integrierten Hepatozyten exprimierten ebenfalls zellspezifische Marker (CKLP 34, Hepatocyte), bildeten wichtige Zell-Zellkontakte wie Tight Junctions und Adherens Junctions aus und proliferierten. Durch die Anfärbung von Tight Junctions ließen sich zwischen den Zellen Gallenkanälchenstrukturen sichtbar machen. Eine Kommunikation zwischen Endothelzellen und Hepatozyten (cellular Cross-Talk) konnte über die Expression von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) belegt werden. Anhand der Mediumproben ließ sich nachgeweisen, dass die Hepatozyten bis zum Ende der Kultur Harnstoff sowie Albumin synthetisierten und Laktat bildeten. Der Phase-I- und Phase-II-Metabolismus von Dextrometorphan war im porcinen Modell ohne Enzyminduktion nachweisbar.

Die Etablierung des Lebermoduls erfolgte zunächst aufgrund der besseren Verfügbarkeit auf Basis porciner Zellen. Die Ergebnisse ließen sich jedoch anschließend auf das humane Modell übertragen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die BioVaSc als Grundlage für ein Lebertestsystem eignet. Das hier aufgebaute System hat als erstes Modell ein Gefäßsystem zur Co-Kultur von Endothelzellen und Hepatozyten unter physiologischen Bedingungen. Erstmals stellt ein Lebermodell damit die Möglichkeit in Aussicht den Transport von im Blut gelösten Molekülen durch die sinusoidale Endothelzellschicht zu den Hepatozyten bzw. von Metaboliten durch die sinusoidale Endothelzellschicht zum Blut zu untersuchen.

The liver plays a decisive role in human metabolism. It is composed of a multiplicity of highly specialised cells which maintain numerous complex and important metabolic functions for the entire organism. In vivo ingested active agents are presented to the liver by the blood circuit and are metabolised by the hepatocytes. These emerging metabolites may have different pharmacological properties than the original drug. Therefore, hepatocyte- and liver-functions represent an interesting system for the analysis of drugs and their degradation products. Presently, various in vitro test systems exist for such studies of metabolism. However, these bottom-of-the range systems are based on isolated liver enzymes, primary cell cultures or liver slices. So far there is no organoid liver model which allows long term studies on primary hepatocytes without loss of cell specific functions. To maintain the function of isolated hepatocytes in culture it is important to mimic their in vivo microenvironment. Aspects of this microenvironment are I) the co-culture with non-parenchymal cells, II) a suitable 3-D scaffold as well as III) a sufficient nutrient and gas supply. For co-culture endothelial cells were chosen in the present work. They affect hepatocyte differentiation and viability by soluble factors like cytokines. EC are also a natural filtration barrier for macromolecules between blood and parenchymal cells. The scaffold used in the present work was made of decellularised porcine jejunal segment. The so called "Biological Vascularised Scaffold" (BioVaSc) is based on a 10 to 15 cm long segment of porcine jejunum conserving its vascular system, which was acellularised by maintaining the existing vessel structures including their basal membrane. Cell- and tissue nutrient supply was implemented by a closed-circuit perfusion of the BioVaSc integrated into a bioreactor system. In this work, an optimised medium composition was developed which was injected through the arterial inflow under pulsatile simulation of natural blood flow. By a control loop it was possible to adapt medium pressure in the organoid structure to the physiological conditions in the liver. The artificial "blood circuit" assured optimal nutrient and oxygen supply. For generating an in vitro organoid liver system the BioVaSc was reseeded with cells in two steps. In the first step, the vascular structures of the scaffold were refunctionalised applying microvascular endothelial cells (mEC) and endothelial progenitor cells. In the second reseeding step, primary hepatocytes in a collagen I suspension were integrated into the scaffold. The resulting co culture system was maintained for 2 -3 weeks. Tissue samples were collected daily to monitor cell functions. After the end of cultivation the whole BioVaSc was fixed for paraffin embedding. Paraffin sections were made for the control of matrix reseeding and cell characterisation by immunohistochemical methods. The differentiation of porcine progenitors into EC could be demonstrated by the expression of endothelial cell specific markers CD 31 and FLK-1. Moreover, human EC integrated into the vascular structures and also expressed those markers denoting early neoangiogenesis.

Hepatocytes on the matrix developed tight and adherent intercellular junctions, expressed cell type specific markers (CKLP 34, Hepatocyte) and proliferated. Bile Canaliculi like structures between abutting hepatocytes were documented by the anti-zona-occludens staining. The expression pattern of VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) suggests a communication between hepatocytes and EC. The maintainance of metabolic functions was analysed by media samples. The detoxifying function of the hepatocytes could be demonstrated up to day 22 by urea synthesis. Albumin synthesis and lactate formation (as general marker for metabolism activity) were also performed until the end of the cultivation. Phase I and II metabolism of dextrometorphan were detectable in the porcine model up to day 22 without any enzyme induction.