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Autor(en): Trodler, Peter
Titel: Untersuchung von Lipasen - Elektrostatik, Selektivität und Einfluss von Lösungsmitteln auf Struktur und Dynamik
Sonstige Titel: Examination of lipases - electrostatics, selectivity and influence of solvents on structure and dynamics
Erscheinungsdatum: 2008
Dokumentart: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-37187
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/939
http://dx.doi.org/10.18419/opus-922
Zusammenfassung: Lipasen katalysieren die Hydrolyse von Estern und die Veresterung. Lipasen sind Biokatalysatoren mit hoher Selektivität, einem breiten Substratspektrum unter milden Bedingungen und sind wichtig in der Anwendung in organischen Synthesen. Ein Merkmal der meisten Lipasen ist die Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Die meisten Lipasen haben einen Deckel, das lid, ein bewegliches Strukturelement das den Zugang zum aktiven Zentrum verschließt. Die Grenzflächenaktivierung ist verbunden mit einem Konformationsübergang von der geschlossenen zur offenen Konformation. Bei Kontakt an eine hydrophobe Grenzfläche wird das lid geöffnet und erlaubt dem Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum. Die Eigenschaften von Lipasen, wie Temperaturstabilität, Selektivität oder Aktivität ändern sich beim Wechsel des Lösungsmittels. In dieser Arbeit wurde der Einfluss organischer Lösungsmittel auf die Struktur und die Dynamik von Lipasen durch Simulationen untersucht. Candida antarctica Lipase B (CALB) ist die wichtigste Lipase in der industriellen organischen Synthese. Im Gegensatz zu den meisten anderen Lipasen hat CALB kein lid und zeigt keine Grenzflächenaktivierung. CALB ist in organischem Lösungsmittel stabil und kann Reaktionen bei höheren Temperaturen katalysieren. Durch Simulationen sollte das Verhalten von CALB in den Lösungsmitteln Methanol, Chloroform, Isopentan, Cyclohexan, Toluol und Wasser untersucht werden. Die Struktur war in allen Lösungsmitteln stabil. Das umgebende Lösungsmittel hatte einen großen Einfluss auf die Flexibilität von CALB, bei einer höheren Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels nahm die Flexibilität zu. Bei kleineren Dielektrizitätskonstanten des Lösungsmittels nahm die Zahl der an die Oberfläche gebundenen Wassermoleküle zu. Durch die größere Zahl an langsam ausgetauschten Wassermolekülen an der Oberfläche bildete sich ein umspannendes Wassernetzwerk. Der Grund der verringerten Flexibilität von CALB in unpolaren Lösungsmitteln war die geringere Beweglichkeit von Wassermolekülen an der Oberfläche und deren langsamerer Austausch. Burkholderia cepacia Lipase (BCL) wurde in Simulationen untersucht. BCL hat ein lid und zeigt Grenzflächenaktivierung an einer hydrophoben Grenzschicht. Zur Untersuchung der Grenzflächenaktivierung wurden Simulationen der offenen und geschlossenen Konformation von BCL in Wasser und Toluol durchgeführt. In der geschlossenen Konformation von BCL in Wasser blieb das lid geschlossen. In Simulationen von geschlossenem BCL in Toluol wurde die Öffnung des lids beobachtet. Die vollständige Öffnung des lids wurde in der Simulation durch Helix α6 blockiert und verhinderte die weitere Bewegung von Helix α5 zur geöffneten Konformation. In der Simulation von offenem BCL in Wasser wurde eine Schließbewegung des lids beobachtet die durch Wechsel des Lösungsmittels reversibel war. In der Simulation der offenen Kristallstruktur in Toluol zeigte das lid eine etwas weitere Öffnung als zu Beginn der Simulation. Kristallkontakte verhindern eine vollständig geöffnete Konformation in der Kristallstruktur. Theoretische Untersuchungen wurden auch mit der experimentellen Arbeit verbunden. Durch rationales Design wurde eine neue einstufige Aufreinigungsmethode für CALB entwickelt. Im Allgemeinen können Lipasen durch Ionen-Austausch Chromatographie aufgereinigt werden. CALB konnte jedoch bisher nicht auf Säulen in der Ionen-Austausch Chromatographie oder der Hydrophoben-Interaktions Chromatographie unter den verwendeten Bedingungen gebunden werden. Bei der elektrostatischen Charakterisierung von CALB wurde ein breiter isoelektrischer Bereich, an Stelle eines isoelektrischen Punkts gefunden. Eine einstufige Aufreinigungsmethode durch Ionen-Austausch Chromatographie für CALB mit Bindung bei pH 3 wurde entwickelt. Das rationale Design einer Aufreinigungsmethode kann auch zur Entwicklung von Aufreinigungsmethoden anderer Proteine verwendet werden. Acrylierung dient zur Einführung von Vernetzungs-Funktionalität in Verbindungen. Chemische Prozesse zur Herstellung von acrylierten Estern bei hohen Temperaturen führen gleichzeitig zur teilweisen Polymerisierung der acrylischen Doppelbindungen. Die Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten sollte für einen biotechnologischen Prozess durch CALB etabliert werden. Die Methode des rationalen Designs wurde zur Erhöhung der Aktivität der Acrylierung von Hydroxypropylcarbamaten durch CALB bis zur vollständigen Umsetzung verwendet. Hydroxypropylcarbamat besteht aus zwei Enantiomerenpaaren von denen ein Enantiomer von CALB kaum acryliert wird. Das schlecht umgesetzte Substrat wurde durch Modellierung identifiziert und Mutanten mit höherer Aktivität vorgeschlagen. Die zur Vergrößerung der Bindetasche des sekundären Alkohols vorgeschlagenen Mutanten an Position 278 waren in der Hydrolyse von Tributyrin und der Acrylierung aktiver als der WT.
Lipases are high selective catalysts for a wide variety of chiral compounds in hydrolysis in water and esterification in organic solvents. The defining characteristic of most lipases is the interfacial activation at a lipid interface or in organic solvents. Most lipases consist of a surface loop, a so called lid, covering the active site and making it accessible for substrates. It has been shown that many enzymes retain activity in organic solvents and have interesting catalytic properties such as high thermostability and altered stereoselectivity. In organic solvents, enzyme-catalyzed esterifications become feasible, and can be efficiently used due to the high solubility of hydrophobic substrates. Candida antarctica lipase B (CALB) is stable in organic solvents without significant loss of activity. CALB has no lid covering the entrance to the active site . The influence of organic solvents on structure and dynamics of CALB has been investigated by multiple molecular dynamics simulations in different solvents. The structures were independent of the solvent, but there is a large influence on the flexibility depending on the dielectric constant of the solvent, with a high flexibility in water and a low flexibility in organic solvents. With decreasing dielectric constant, the number of surface bound water molecules significantly increased and a spanning water network with an increasing size was formed. Burkholderia cepacia lipase (BCL) has a lid and shows interfacial activation. The interfacial activation was examined by multiple molecular dynamics simulations of closed and opened BCL in water and toluene to investigate the influence on structure and flexibility. In simulations of closed BCL in water no opening of the lid was observed. In simulations of closed BCL in toluene the lid was opening and an energetic barrier was identified preventing from further opening. In simulations of open BCL in water the lid was slightly closing. The movement of the lid was reversible by changing the solvent. Further opening of the lid compared to the crystal structure was observed in simulations of open BCL in toluene. The fully open conformation in the crystal structure was prevented by crystal contacts between the β-hairpin loop and the helices α4 and α5 in the lid. Theoretical investigations were also combined with experimental work in purification and biocatalysis. Generally, lipases can be purified by ion-exchange chromatography or additional chromatographic steps. However, CALB has been shown not to bind to any chromatographic material at the used conditions. In this case study CALB was characterized by electrostatic calculations. A fast and efficient one-step method for purification of CALB by ion-exchange chromatography was developed by rational design. The electrostatic properties of the enzyme were calculated and validated by isoelectric focusing and the measurement of the titration curve. CALB shows an unusual pH profile with a broad isoelectric region from pH 4 to 8. CALB can be bound on a cation-exchange chromatography column at pH 3 and was purified to homogeneity without significant loss of activity. The broad isoelectric region of CALB is unique as compared to almost all other α/β-hydrolases, which have a well-defined isoelectric point. The rational design of a purification strategy is also useful for other enzymes and can reduce experimental efforts. CALB is a highly versatile catalyst with activity towards a wide range of substrates. Acrylation is a practical way of introducing cross-linking functionality to a target compound. Traditional chemical processes were used for producing acrylate esters at high temperatures frequently leading to polymerization of acrylic double bonds. CALB can also catalyze acrylation of hydroxypropylcarbamates, which is an attractive alternative to chemical processes. The acrylation of a mixture of primary and secondary hydroxypropylcarbamates was not fully converted by CALB WT. By molecular modeling positions for mutations for higher activity were identified. The slowly reacting substrate in the enzyme-catalyzed acrylation of hydroxypropyl-carbamates was identified. Thus, it was suggested to increase the volume of the binding pocket by substitution at position 278 by site directed mutagenesis. Substitution of Leu by Ala at position 278 had a strong effect on the hydrolysis activity of tributyrine and in the acrylation compared to the wild type.
Enthalten in den Sammlungen:03 Fakultät Chemie

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