Analysis of receptor-ligand interactions with new single chain TNF constructs

Abstract

Different models for the binding of the ligand tumour necrosis factor (TNF) to its receptors can be imagined. In a first model the homotrimeric ligand merges three single receptor molecules upon binding. Thereby their intracellular parts are brought into proximity, which enables signal initiation. Based on the discovery of a preassociation of the TNF receptors prior to ligand binding, a distinct model was proposed, in which the TNF trimer binds at once to several preassociated receptor molecules. A conformational change in the receptor molecules could then bring the intracellular receptor parts in proximity thereby initiating signalling. In the TNF derivative single chain TNF (scTNF) the three TNF monomers are linked by two Glycine-Serine linkers. The observed reversible dissociation of the TNF homotrimer in its monomers is thereby prevented. Furthermore it is possible to mutate single receptor binding sites in the trimer thereby generating TNF trimers with only one or only two active binding sites. With these molecules it is possible to draw conclusions on the binding mode of TNF. If TNF binds to several preaggregated receptor molecules at once, one would expect a strong reduction in affinity in saturation binding studies at 0°C. If TNF binds only to one single receptor or to only one receptor of a preformed aggregate, the omission of single binding sites should have no strong effects. Using this approach it was possible to show in this work that TNF receptor 2 (TNFR2) must exist in a preaggregated state prior to ligand binding, most likely as a receptor homotrimer. For TNF receptor 1 (TNFR1) the existence of preformed dimers can be assumed, because inactivation of one single binding site shows no significant effects on binding. Only when a second receptor binding site of scTNF was impaired, affinity was reduced. By using another mutation influencing receptor binding also with a scTNF with two impaired binding sites no effect on binding affinity was achieved. However, this could be the case because of a comparably weak impact of the used mutation on receptor binding in general. Alternatively, an aggregation of single receptor molecules or of receptor dimers/trimers by the ligand can be discussed. Hence the model of binding to already preaggregated receptors could be clearly proven, at least for TNFR2. Furthermore it was shown that there exist clear differences in ligand interaction between the two TNF receptors. This might be caused by the structural differences between the receptors (differences in stem- and transmembrane domains) and/or a localisation in different areas of the cell membrane (membrane microdomains). The partially detectable bioactivity of TNF trimers with only one binding site displaying full binding properties further gives a hint for the existence of higher aggregates of several ligand molecules, their bound receptors and intracellular signalling molecules. A signal initiation between two adjacent receptor molecules each bound to another TNF trimer could explain the observed residual activity.

Für die Bindung des Tumor Nekrose Faktors an seine Rezeptoren sind unterschiedliche Modelle vorstellbar. Zum einen ist es naheliegend, dass der als Homotrimer vorliegende Ligand drei einzelne Rezeptormoleküle zusammenführt und dadurch die intrazellulären Rezeptorbereiche angenähert werden, was letztendlich die Signalinitiierung ermöglicht. Ausgehend von der Entdeckung, dass die TNF-Rezeptoren schon in Abwesenheit des Liganden voraggregiert auf der Membran vorliegen, wurde jedoch ein neues Modell vorgeschlagen, bei dem das TNF Trimer zugleich mehrere voraggregierte Rezeptormoleküle bindet. Eine Konformationsänderung in den Rezeptormolekülen könnte dann zur Signalinitiierung führen. In dem TNF Derivat single chain TNF (scTNF) sind die drei TNF Monomere über zwei Glycin-Serin Linker kovalent verknüpft. Die sonst beobachtbare reversible Dissoziation des TNF-Homotrimers in seine Monomere kann dadurch verhindert werden. Zudem ist es möglich einzelne Rezeptorbindestellen im TNF-Trimer zu mutieren und dadurch TNF-Derivate mit nur einer oder nur zwei voll bindungsfähigen Bindestellen herzustellen. Mit Hilfe dieser Moleküle ist es möglich Rückschlüsse auf die Art und Weise, mit der TNF an seine Rezeptoren bindet, zu ziehen. Bei einer gleichzeitigen Bindung an mehrere Rezeptoren würde in Gleichgewichtsbindungsstudien bei 0°C ein starker Abfall der Affinität zu erwarten sein. Bei der Bindung an einen einzelnen Rezeptor oder an ein Molekül eines Rezeptoraggregats, sollte ein Wegfall einzelner Bindungsstellen keinen großen Einfluß haben. Mit diesem experimentellen Ansatz war es in vorliegender Arbeit möglich zu zeigen, dass der TNF Rezeptor 2 (TNFR2) voraggregiert vorliegen muß, sehr wahrscheinlich als Homotrimer. Für TNFR1 wird aufgrund der erhaltenen Ergebnisse ein Vorliegen von Dimeren vermutet, da das Inaktivieren einer Bindungsstelle keinen Effekt zeigte. Erst das Mutieren einer weiteren Bindungsstelle führte zu einer Affinitätsabnahme. Bei der Verwendung einer weiteren, die Bindung beeinflussenden Mutation wurde jedoch auch mit einem scTNF mit zwei beeinflußten Bindungsstellen auf TNFR1 nur ein minimaler Effekt auf die Bindungsfähigkeit erzielt. Dies könnte man sich jedoch mit einer im Vergleich eher schwachen Auswirkung der verwendeten Mutation auf die Rezeptoraffinität erklären. Alternativ kann eine Aggregierung von einzelnen Rezeptormolekülen oder von Rezeptor Dimeren oder Trimeren durch den Liganden diskutiert werden. Somit konnte das Model der Bindung an schon voraggregierte Rezeptoren zumindest für TNFR2 eindeutig belegt werden. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass deutliche Unterschiede zwischen beiden Rezeptoren vorhanden sind. Dies mag in der unterschiedlichen Struktur der Rezeptoren begründet sein (Unterschiede in Stiel- und Transmembrandomäne) und/oder in einer Lokalisation in verschiedenen Bereichen der Zellmembran (Mikrodomänen). Die teilweise noch nachweisbare Bioaktivität eines TNF Trimers mit nur einer voll bindefähigen Rezeptorbindestelle ist zudem ein Hinweis auf die Existenz größerer Aggregate bestehend aus mehreren Liganden, ihren gebundenen Rezeptoren und intrazellulären Signalproteinen. Eine Signalinitiation durch zwei benachbarte Rezeptormoleküle jeweils gebunden an ein anderes TNF-Trimer könnte die vorhandene Restaktivität erklären.