Ubx4 moduliert die Aktivität von Cdc48 und beeinflusst die Degradation von fehlgefalteten sekretorischen Proteinen im endoplasmatischen Retikulum

Abstract

Sekretorische Proteine werden im endoplasmatischen Retikulum (ER) einer Qualitätskontrolle unterzogen. Bei richtiger Faltung erfolgt ein Vesikel basierender Transport an den Ort, an dem das Protein seine Funktion ausübt. Fehlgefaltete Proteine werden dem sekretorischen Weg entzogen, über den Prozess der ER abhängigen Proteindegradation (ERAD) vom ER ins Cytosol zurück geschleust und dort über das Ubiquitin-Proteasom System (UPS) abgebaut. Ein zentraler Schritt in diesem Abbauweg auf der cytosolischen Seite des ER wird von der AAA ATPase Cdc48 (p97 in höheren Eukaryonten) ausgeübt. Die Energie aus der Hydrolyse von ATP durch Cdc48 wird in mechanische Kraft umgesetzt, um Substratproteine zu entfalten und diese von Proteinkomplexen oder Lipidmembranen zu lösen. Dabei wird die Aktivität von Cdc48 von vielen Kofaktoren beeinflusst. Ufd1-Npl4, ein dimerer Kofaktor, dirigiert Cdc48 zu Degradationsprozessen und unterstützt die Bindung zu polyubiquitinierten Proteinen. Das ER Membranprotein Ubx2, welches eine UBX Domäne besitzt, über die Cdc48 an die Membran rekrutiert wird, sorgt für den Kontakt zwischen E3 Ligasen und dem für den Abbau vorgesehenen Substrat. Ziel meiner Arbeit war eine Charakterisierung des Kofaktors Ubx4, der in einem Wachstumstest als ein Protein gefunden wurde, welches am ER assoziierten Abbau von fehlgefalteten Proteinen beteiligt ist. Um die Ergebnisse der Wachstumstests zu bestätigen, wurden Pulse Chase Analysen fehlgefalteter Substratproteine durchgeführt. Dabei zeigte sich in Hefestämmen mit einer Deletion des UBX4 Gens ein gestörter Abbau für verschiedene Modellsubstrate. In Zellfraktionierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass Ubx4 sich in Bezug auf sein Membranverhalten wie Cdc48 verhält. Nach einem Ultrazentrifugationsschritt wird ein Teil von Ubx4 und Cdc48 in der Membranfraktion gefunden. Dieser Anteil lässt sich mit Harnstoff von der Membran ablösen und man kann deshalb von Membran assoziierten Proteinen sprechen. Ubx4 besitzt eine N-terminale UBL ("Ubiquitin-like") Domäne und eine C-terminale UBX ("Ubiquitin regulatory X") Domäne. Je eine der beiden Domänen wurde in einem Hefestamm chromosomal deletiert und so ließ sich feststellen, dass nur die UBX Domäne für den Abbau des fehlgefalteten Substrates CPY* verantwortlich ist. Weitere Bindungsstudien bestätigten die schon publizierte direkte Interaktion der UBX Domäne von Ubx4 mit der N-terminalen Domäne von Cdc48. Eine weitere Untermauerung der Funktion von Ubx4 in der ER assoziierten Degradation wurde durch den Nachweis der Interaktion mit dem den Kofaktor fd1-Npl4 enthaltenden Cdc48 Komplex erbracht. Dieser gut untersuchte dimere Kofaktor wurde bereits mit Ubx2 in einem Komplex gefunden. Hier ergab sich die Frage, ob Ubx4 und Ubx2 zeitgleich an Cdc48 binden können. Dies ist nicht der Fall. Die Akkumulation von fehlgefaltetem CPY* und polyubiquitiniertem Material an Cdc48 in einem ubx4 Stamm und die stärkere oder längere Interaktion mit der E3 Ligase Der3/Hrd1 zeigen, dass Ubx4 beim Ablösevorgang des mit polyubiquitiniertem Proteinmaterial beladenen Cdc48-Ufd1-Npl4 Komplexes von der Membran des ER eine wichtige Rolle spielt. Außerdem führt die Abwesenheit von Ubx4 am Cdc48 Komplex zu Problemen bei der Freisetzung von polyubiquitiniertem Proteinmaterial.

Secretory proteins undergo a proofreading process in the endoplasmic reticulum (ER). After reaching their correct folding state they are packed into vesicles for transport to their final destination. Misfolded proteins are removed from the secretory process, transported back into the cytosol and are then degraded via the ubiquitin-proteasome system (UPS). This process is termed ER-associated protein degradation (ERAD). A critical step in this degradation pathway on the cytosolic side of the ER is the unfolding and extraction of the misfolded protein from the ER via the AAA ATPase Cdc48 (p97 in mammals). On the molecular level the energy of hydrolysis of ATP by Cdc48 is transformed into mechanical force to separate substrate proteins from complexes or lipid membranes. The activity of Cdc48 is modulated through different cofactors of Cdc48. Ufd1-Npl4, a well-known dimeric cofactor of Cdc48, is required for degradation processes and supports Cdc48 in ubiquitin binding. Ubx2, a membrane protein in the ER membrane with both termini facing into the cytosol, binds to Cdc48 via its UBX domain and recruits Cdc48 to substrates, E3 ligases and other ERAD components. The aim of my work was to characterize the cofactor Ubx4 which was found in a growth assay which indicated its participation in ERAD. To confirm the results of the growth assay pulse chase experiments of misfolded proteins were performed. These experiments showed that Ubx4 is indeed involved in the degradation of different ERAD substrates. In cell fractionation experiments it was shown that Ubx4 localizes at the microsomal fraction after high-speed centrifugation. The same result was observed for Cdc48. This fraction of Ubx4 is completely washed off the membrane by treatment of urea. It was therefore concluded that Ubx4 is only membrane associated. Ubx4 contains an N-terminal UBL domain ("Ubiquitin like") and a C-terminal UBX domain ("Ubiquitin regulatory X"). Different mutant proteins of Ubx4 were created and deleted in either the UBX or the UBL domain on the chromosome. With these strains it was shown that the degradation of CPY* is dependent only on the presence of the UBX domain of Ubx4. Further binding studies confirmed the already published data of the interaction of Cdc48 with the UBX domain of Ubx4. An additional proof for Ubx4 to be involved in ERAD was the finding that Ubx4 interacts with the complex containing the dimeric cofactor Ufd1-Npl4. This well-known cofactor was also shown to be in a complex of Cdc48 together with the linker protein Ubx2. The question arose if Ubx4 and Ubx2 bind to the Cdc48 complex at the same time at different protomers. This was not the case. Because of accumulation of misfolded CPY* and polyubiquitinated material on Cdc48 in a UBX4 deleted strain and a stronger or longer contact to the E3 ligase Der3/Hrd1 we propose that Ubx4 is required for the release step of the Cdc48 complex together with polyubiquitinated material from the ER membrane. Furthermore in the absence of Ubx4 the Cdc48 complex shows defects in the release step of polyubiquitinated proteins on the way to the proteasome.