Cytochrom P450-Monooxygenasen : Modellierung, Datenbankanalyse und experimentelle Charakterisierung neuer Enzymvarianten

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Cytochrom P450-Monooxygenasen. Vertreter dieser Enzymsuperfamilie sind aufgrund ihrer Beteiligung am Medikamentenstoffwechsel des Menschen, sowie ihrer Fähigkeit eine Vielzahl chemischer Verbindungen stereo- und regioselektiv zu oxidieren Gegenstand intensiver Forschung. Die genaue Vorhersage des von P450-Monooxygenasen verursachten Medikamentenstoffwechsels ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Wirksubstanzen. Weiterhin sind einige Vertreter dieser Enzymsuperfamilie für biotechnologische Anwendungen interessant. Aufgrund ihrer hohen Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten, einem breiten Substratspektrum und relativer Prozessstabilität erweisen sich dabei Varianten der bakteriellen P450-Monooxygenase CYP102A1 (P450 BM-3) als besonders vielversprechend. Für die effiziente Anwendung von P450-Monooxygenasen ist jedoch häufig die Verbesserung bestimmter biochemischer Eigenschaften, wie der Regio-, Stereo- und Chemoselektivität unerlässlich. Eine wichtige Voraussetzung für die gezielte Verbesserung dieser Eigenschaften sowie für genaue Vorhersagen des von P450-Monooxygenasen verursachten Medikamentenstoffwechsels ist das Verständnis der molekularen Grundlagen von Aktivität, Spezifität und Selektivität. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit widmet sich daher der Untersuchung von Substrat-Enzym-Wechselwirkungen von Cytochrom P450-Monooxygenasen zur Identifizierung von selektivitätsbestimmenden Regionen. Hierzu wurde beispielhaft die Dynamik des CYP2C9-Warfarin-Komplexes mittels multipler molekulardynamischer Simulationen untersucht. Die Simulationsexperimente zeigten stark bewegliche Strukturelemente, welche die Bildung von Kanälen von der Proteinoberfläche ins Innere bewirken. Diese Kanäle ermöglichen den Austausch von Substraten und Produkten zwischen der Proteinumgebung und dem aktiven Zentrum. Die Beweglichkeit dieser Strukturelemente erlaubt darüber hinaus die Adaption des Enzyms an Substrate verschiedener Größe und Form. Die Regioselektivität wiederum wird durch einen engen trichterförmigen Hämzugangskanal kontrolliert, welcher vom starren Proteinkern gebildet wird. Dieser gewährt nur den Teilen des Substratmoleküls, die durch den Trichter passen, einen Zugang zum aktivierten Häm-Sauerstoff. Aminosäuren, die den Hämzugangskanal bilden, sind folglich von großer Bedeutung für die Orientierung des Substrats in der Nähe des Häms. Diese Erkenntnis führte zur Vorhersage von Aminosäuren mit starkem Einfluss auf die Regioselektivität in CYP2C9. Daraufhin wurden verschiedene P450-Monooxygenasen in dem für die Kontrolle der Regioselektivität wichtigen Bereich verglichen. Wegen ihrer direkten Nachbarschaft zu dem in der Sequenz und in der Struktur hoch konservierten ExxR-Motiv wurde die Region um die Substraterkennungsstelle 5 (SRS-5) für eine systematische Analyse von 31 Kristallstrukturen und über 6300 Sequenzen ausgewählt. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass P450-Monooxygenasen in dieser Region in Sequenz und Struktur variabel sind. Es wurde eine positiv geladene mit der Hämgruppe interagierende Aminosäure am C-terminalen Ende der SRS-5 Region in 29 Strukturen sowie in 97,7% aller Sequenzen identifiziert. Die Konformation der Region ist abhängig von der Position dieser Aminosäure nach dem konservierten ExxR-Motiv. Dabei zeigte sich, dass P450-Monooxygenasen hinsichtlich der Position dieser positiv geladenen Aminosäuren klassifiziert werden können. Die beobachteten Konformationen unterscheiden sich auch hinsichtlich der Position von zum Hämzentrum ausgerichteten Aminosäuren. Diese Aminosäuren beeinflussen die Orientierung von Substraten in der Nähe der Hämgruppe und haben damit einen starken Einfluss auf die Spezifität und Selektivität. Mit Hilfe der hier aufgeklärten Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehungen können solche Aminosäuren ausschließlich anhand der Proteinsequenz ohne Kenntnis der Proteinstruktur identifiziert werden. Dies erlaubte das Aufstellen von Regeln zur einfachen Identifizierung zweier Positionen mit großem Einfluss auf Spezifität und Selektivität nur anhand von Sequenzinformationen. Die Prädiktivität dieser Regeln wurde mit Hilfe experimenteller Literaturdaten bestätigt. Im letzten Teil der Arbeit wurden die bis dahin gewonnenen Erkenntnisse genutzt, um neue Varianten der für biotechnologische Prozesse vielversprechenden bakteriellen P450-Monooxygenase CYP102A1 zu generieren. Ziel war es hierbei die Regio, Stereo- und Chemoselektivität des Enzyms gegenüber verschiedenen Substraten zu erhöhen, sowie das Produktspektrum zu verändern. Zu diesem Zweck wurde eine Bibliothek von CYP102A1-Varianten erstellt, welche Mutationen in nur zwei Positionen aufweisen. Eine dieser Positionen wurde im Rahmen dieser Arbeit als hotspot für Selektivität und Spezifität identifiziert und kann in der Sequenz fast aller P450-Monooxygenasen lokalisiert werden. Die zweite Position wurde in vorangegangen Arbeiten als hotspot für Selektivität und Spezifität in CYP102A1 identifiziert. Durch Kombination von 5 hydrophoben Aminosäuren in beiden hotspot Positionen wurde eine Mutantenbibliothek minimaler Größe bestehend aus 24 Einfach- und Doppelmutanten generiert. Ziel war es dabei, kooperative Effekte von Mutationen in beiden hotspot Positionen zu induzieren, welche aufgrund der räumlichen Nähe beider Positionen erwartet wurden. Diese Mutantenbibliothek wurde mit vier Terpenen ((4R)-Limonen, (+)-Valencen, Nerylaceton und Geranylaceton) unterschiedlicher Größe und Form durchmustert. Nach der Entwicklung einer umfassenden Analytik zur Identifizierung der gebildeten Oxidationsprodukte konnte gezeigt werden, dass 11 Enzymvarianten ein verändertes Produktspektrum und/oder verbesserte Regio- und Stereoselektivität aufweisen. Zu den gebildeten Oxidationsprodukten gehört der wertvolle Aromastoff (+)-Nootkaton. Weiterhin werden hier erstmalig CYP102A1-Varianten vorgestellt, welche bevorzugt die 11- und 12-Hydroxyprodukte von Geranyl- und Nerylaceton produzieren. Dabei handelt es sich um wertvolle Ausgangsstoffe für die Synthese von Naturstoffen. Es zeigte sich, dass kooperative Effekte von Mutationen in beiden hotspots entscheidend für die Erhöhung der Selektivität von CYP102A1 gegenüber den sperrigeren Substraten (+)-Valencen und (4R)-Limonen sind.

The present work deals with cytochrome P450 monooxygenases. Members of this enzyme superfamily are subject of intense research due to their participation in the human drug metabolism, as well as their ability to oxidise a wide variety of chemical compounds regio- and enantioselectively. An accurate prediction of the CYP related drug metabolism in Homo sapiens can aid in the design and development of new drugs. Furthermore, some members of this enzyme superfamily are promising candidates for applications in biotechnology. Variants of CYP102A1 from Bacillus megaterium (P450 BM-3) are particularly promising due to a high activity towards various substrates, a broad substrate acceptance and relative stability under process conditions. However, for the application of CYP enzymes in biotechnological processes regio- and stereoselectivity often has to be improved. A prerequisite for rational protein engineering, as well as accurate predictions of the CYP related human drug metabolism is the understanding of the molecular basis of activity, specificity and selectivity. In the first part of this work enzyme-substrate interactions were investigated to identify selectivity determining regions in cytochrome P450 monooxygenases. Therefore, the protein dynamics of the CYP2C9-warfarin complex were examined by molecular dynamics simulations. The results show that mobile structural elements cause the formation of channels between the substrate binding cavity and the protein surface, which facilitate the transfer of substrates and products between the active site and the bulk solvent, as well as the adaptation of the enzyme to substrate molecules with different size and shape. However, regioselectivity is determined by a narrow funnel like region, which is formed by the rigid protein core. This funnel greatly reduces the number of possible substrate orientations above the activated heme oxygen. As a consequence, amino acids which are involved in the formation of this funnel like region were predicted to have a pronounced effect on regioselectivity in CYP2C9. In the second part of this work, the regions which correspond to the selectivity determining region in CYP2C9 were identified in different cytochrome P450 monooxygenases and compared. Due to its direct proximity to the structurally and sequentially conserved ExxR motif it was possible to systematically analyse the substrate recognition site 5 (SRS-5) in 31 crystal structures and more than 6300 protein sequences. The results of this analysis showed that the SRS-5 region is variable in sequence and structure. A positively charged heme-interacting residue was identified at the C-terminal end of the SRS-5 region in 29 structures and in 97.7% of all sequences. The conformation of the SRS-5 region depends on the position of this amino acid after the conserved ExxR motif. The results presented here show that P450 monooxygenases can be classified according to the position of this positively charged heme-interacting residue. The observed conformations also differ in terms of the position of amino acids, whose side chains point towards the heme centre. These amino acids influence the orientation of substrates close to the activated heme oxygen and thus have a strong influence on specificity and selectivity. With the help of the sequence-structure-function relationships unveiled in this work, these amino acids can be identified from sequence even in the absence of protein structure information. These findings allowed us to derive rules on how to readily identify two positions with strong influence on selectivity and specificity from protein sequence alone. The predictivity of these rules was validated with experimental data from the literature. The knowledge derived in this work was used to create new variants of CYP102A1, since this enzyme is one of the most promising monooxygenases for applications in biotechnology. The aim was to improve regio-, stereo-, and chemoselectivity of this enzyme towards different substrates. Therefore, a small library of CYP102A1 variants with mutations in only two positions was created. One of these positions was identified as a hotspot for selectivity and specificity in this work and can be localised in the sequence of almost all P450 monooxygenases. The second position was previously identified as a hotspot for selectivity and specificity in CYP102A1. The combination of 5 hydrophobic amino acids in both hotspot positions resulted in a mutant library of minimal size, which consists of 24 single and double mutants. The aim was to induce cooperative effects of mutations in both hotspot positions, which were expected due to the spatial proximity of both positions. This mutant library was screened with four differently sized and shaped terpenes ((4R)-limonene, (+)-valencene, nerylacetone, and geranylacetone). After developing a comprehensive analysis to identify the formed oxidation products we could show that 11 enzyme variants revealed a changed product profile and strongly improved regio- and stereoselectivity. The valuable flavour compound (+)-nootkatone is among the formed oxidation products. Furthermore, for the first time it was shown that CYP102A1 variants preferentially oxidise geranyl- and nerylacetone at allylic positions to form 11- and 12-hydroxyproducts. These compounds are valuable starting materials for the total synthesis of natural products. The results presented here indicate that cooperative effects induced by combined mutations in both hotspot positions are required to improve selectivity towards the more bulky substrates (4R)-limonene and (+)-valencene.