Identification of novel protein binding partners for the tumor suppressor DLC1

Abstract

Cancer, one of the major chronic health problems worldwide, is a genetic disease, which requires the cooperation of gain-of-function and/or loss-of-function mutations to either oncogenes or tumor suppressor genes, respectively. In the last decade, the Deleted in Liver Cancer (DLC) 1 gene has emerged as a novel tumor suppressor downregulated in a variety of cancer types including breast, liver, prostate and lung. DLC1 is a multidomain protein consisting of an N-terminal sterile alpha motif (SAM), a C-terminal START and an internal Rho GTPase activating (GAP) domain. Due to GAP-dependent and -independent mechanisms that are still poorly understood DLC1 is able to inhibit proliferation, migration and invasion of tumor cells. The goal of this thesis was the identification of novel DLC1 protein binding partners, in order to gain deeper insight into DLC1 regulation and molecular function. Therefore, a yeast-two-hybrid screen based on the Gal4-system was performed, using the DLC1 SAM domain as a bait and a cDNA library derived from human breast tissue as a prey. One of the 16 putative binding candidates identified was the phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN), which is also a tumor suppressor frequently deleted or mutated in sporadic tumors of the breast, prostate, endometrium and brain. PTEN consists of an enlarged catalytic site that acts as a dual-specificity phosphatase for proteins and lipids. By dephosphorylation of its major lipid substrate phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3) the PI3K signaling pathway is downregulated and cell proliferation and survival mediated by Akt/PKB activation are inhibited. Cell spreading and cell motility are also suppressed by PTEN activity. Pulldown assays and coimmunoprecipitation of DLC1 and PTEN confirmed association of the proteins in mammalian cells. The interaction of both proteins was stimulated upon PTEN activation by PDGF treatment, correlating with their colocalization at the plasma membrane. In overexpression experiments synergistic effects of the two proteins with regard to downstream signaling could not be observed. However, simultaneous loss of DLC1 and PTEN in the non-invasive MCF7 breast carcinoma cell line using RNA interference enhanced migration in an additive manner in wounding as well as in chemotactic transwell assays compared to singly depleted cells. These results suggest that the spatio-temporally restricted formation of a DLC1/PTEN complex, simultaneously inhibiting its individual downstream targets, guarantees the synchronization of cell migration processes. Thus, loss of both proteins is proposed to facilitate malignant transformation by increasing the metastatic potential of tumor cells. Another putative DLC1 binding partner identified in the yeast-two-hybrid screen was liprin beta2 that belongs to a protein familiy comprising four alpha- and two beta-type family members, which all contain a C-terminal highly conserved liprin homology (LH) domain consisting of three SAM domains. Association of full-length DLC1 with liprin beta2 as well as with the additional family members liprin alpha1 and beta1 was confirmed biochemically by coimmunoprecipitation. Liprins are multivalent proteins that form complex structures due to homo- and heterodimerization. Additionally, alpha-type liprins interact with the LAR subfamily of receptor protein-tyrosine phosphatases, which are heterophilic receptors involved in cell adhesion and cell motility. Given the function of liprins as adaptor proteins at membrane proximal sites, it is conceivable that they contribute to DLC1 localization and/or scaffolding. It is thus of particular interest to investigate the biological impact of DLC1 binding to liprin proteins in future studies.

Krebs, eines der größten chronischen Leiden weltweit, ist eine genetische Erkrankung, die die Kooperation von so genannten "Gain-of-Function" und/oder "Loss-of-Function" Mutationen in entweder Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen bedingt. Das "Deleted in Liver Cancer (DLC) 1" Gen, das in einer Vielzahl von Krebsarten wie Brust-, Leber- und Lungenkrebs herunterreguliert ist, wurde in den letzten zehn Jahren als neuer Tumorsuppressor entdeckt. DLC1 besitzt ein N-terminales steriles-alpha-Motiv (SAM), eine C-terminale START und eine interne Rho-GTPase-aktivierende (GAP) Domäne. Infolge GAP-abhängiger und –unabhängiger Mechanismen, die bisher noch kaum verstanden sind, ist DLC1 fähig, Proliferation, Migration und Invasion von Tumorzellen zu inhibieren. Das Ziel dieser Dissertation war die Identifizierung neuer DLC1 Proteinbindungspartner, um ein besseres Verständnis der DLC1 Regulation und molekularer Funktion zu gewinnen. Zu diesem Zweck wurde ein Hefe-zwei-Hybrid Screen basierend auf dem Gal4-System durchgeführt, in dem die DLC1 SAM-Domäne als Köder und eine cDNA Bibliothek aus humanem Brustgewebe als Beute benutzt wurden. Einer der 16 identifizierten Bindungskandidaten war "Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome Ten" (PTEN), ebenfalls ein Tumorsuppressor, der häufig in sporadischen Tumoren der Brust, Prostata, des Endometriums und Gehirns deletiert oder mutiert ist. PTEN besteht aus einer ausgedehnten katalytischen Region, die als dual-spezifische Phosphatase für Proteine und Lipide agiert. Durch Dephosphorylierung seines Haupt-Lipidsubstrates Phosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphat (PIP3) wird der PI3K Signalweg herunterreguliert, wodurch Zellproliferation und Überleben vermittelt durch Akt/PKB Aktivierung inhibiert werden. Zellausbreitung und zelluläre Motilität werden ebenfalls durch PTEN-Aktivität supprimiert. "Pulldown" Versuche und Koimmunopräzipitation von DLC1 und PTEN bestätigten die Assoziation der Proteine in Säugetierzellen. Die Interaktion beider Proteine konnte durch PDGF-vermittelte PTEN Aktivierung stimuliert werden, korrelierend mit ihrer Kolokalisation an der Plasmamembran. In Überexpressionsstudien konnten keine synergistischen Effekte der zwei Proteine hinsichtlich nachgeschalteter Signalwege beobachtet werden. Allerdings steigerte der durch RNA Interferenz hervorgerufene gleichzeitige Verlust von DLC1 und PTEN in der nicht-invasiven MCF7 Brustkrebszelllinie die Migration in "Wounding" als auch in chemotaktischen "Transwell Assays" additiv verglichen mit einfach-depletierten Zellen. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die räumlich und zeitlich begrenzte Formierung eines DLC1/PTEN Komplexes, der in koordinierter Weise die individuellen nachgeschalteten Zielmoleküle inhibiert, die Synchronisation von Zellmigrationprozessen garantiert und dass somit der Verlust beider Proteine die maligne Transformation durch die Erhöhung des metastatischen Potentials von Tumorzellen fördert. Ein weiterer Bindungspartner von DLC1, der in dem Hefe-zwei-Hybrid Screen identifiziert wurde, war Liprin beta2, das zu einer Proteinfamilie gehört, die vier alpha- und zwei beta-Typ Familienmitglieder umfasst, von denen alle eine C-terminale, hoch konservierte Liprin-Homologie (LH) Domäne gebildet aus drei SAM-Domänen besitzen. Assoziation von "full-length" DLC1 mit Liprin beta2 sowie mit den weiteren Familienmitgliedern Liprin alpha1 und beta1 wurde biochemisch durch Koimmunopräzipitation bestätigt. Liprine sind multivalente Proteine, die komplexe Strukturen aufgrund von Homo- und Heterodimerisierung bilden. Desweiteren interagieren die alpha-Typ Liprine mit der LAR Subfamilie der Rezeptor-Protein-Tyrosinphosphatasen, heterophile Rezeptoren, welche an Zelladhäsion und Zellmotilität beteiligt sind. Angesichts der Funktion von Liprinen als Adaptorproteine an membrannahen Stellen ist es denkbar, dass sie zur Lokalisation und/oder zum "Scaffolding" von DLC1 beitragen. Es ist daher von besonderem Interesse, in zukünftigen Studien die biologische Wirkung der DLC1-Bindung an Liprine zu untersuchen.