DNA-Microarrays zur parallelen Detektion und Genotypisierung toxischer Cyanobakterien

Abstract

Diese Arbeit präsentiert die Entwicklung eines Oligonukleotid-Microarrays zur Detektion von Cyanobakterien und dessen Anwendung zur Untersuchung von über 200 Wasserproben aus Baikalsee und Bodensee. Des Weiteren wurde erstmalig die Anwendung von ROC-Analysen zur Optimierung von Genotypisierungs-Arrays vorgestellt. Basierend auf 16S rDNA-Sequenzen wurden Sonden zur parallelen Detektion von Bakterien, Cyanobakterien und der potentiell toxischen Gattungen Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Nodularia, Planktothrix und Cylindrospermopsis entwickelt. Weitere Sonden wurden zur Detektion verschiedener Spezies der nicht toxischen Gattung Synechococcus entwickelt. Der DNA-Microarray ermöglichte zusätzlich eine Unterscheidung zwischen potentiell toxischen und nicht toxischen Spezies der Gattung Microcystis durch eine Detektion des mcyA-Gens. Beide Zielgene (16S rDNA und mcyA) wurden dafür mittels Duplex-PCR simultan amplifiziert und fluoreszenzmarkiert, wodurch eine parallele Detektion sowohl der Gattung und Spezies, als auch des Toxizitätspotentials möglich ist. Alle Sonden wurden mit Hilfe von 30 Referenzstämmen in 170 Hybridisierungen validiert, bevor der DNA-Microarray zur Untersuchung von Umweltproben eingesetzt wurde. Der Vergleich verschiedener DNA-Extraktionsverfahren und die anschließende Optimierung jedes einzelnen Arbeitsschrittes führten zu einem sehr robusten Detektionssystem. Zusätzlich wurden grundsätzliche Untersuchungen zur Optimierung von Oligonukleotidsonden für DNA-Microarrays durchgeführt. Neben einer hohen Spezifität konnte auch eine ausreichende Sensitivität erreicht werden. Die Nachweisgrenze für Synechococcus-Spezies lag bei 2000 Zellen/ml. Mischungsanalysen zeigten, dass selbst in einem hohen Hintergrund aus nicht-toxischen Cyanobakterien des Baikalsees (1,3 x 105 Zellen/ml), das Toxingen mcyA noch von knapp unter 6200 Zellen/ml Microcystis viridis detektiert werden konnte. Nicht-toxische Cyanobakterien der Gattung Synechococcus konnten in fast allen Umweltproben des Baikal- und Bodensees in 0-30 m Tiefe detektiert werden. In keiner der Wasserproben konnten toxische Cyanobakterien gefunden werden. Alle Ergebnisse konnten mit klassischen, mikrobiologischen Methoden durch die Projektpartner bestätigt werden. Um eine schnelle und übersichtliche Erfassung und Auswertung umfangreicher Arraydaten zu gewährleisten wurden zusätzlich zum ROC-Analyse-Modul weitere Auswertungs-Module entwickelt, wodurch eine signifikante Zeitersparnis erreicht werden konnte. Zusätzlich wurde ein transportables Protokoll etabliert, welches den Einsatz von DNA-Microarrays im Feldversuch ermöglicht. Es konnte erfolgreich an Bord eines Forschungsschiffes auf dem Baikalsee getestet werden. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte System kann damit zur schnellen und robusten Detektion von potentiell toxischen und nicht-toxischen Cyanobakterien in Trinkwasserreservoirs eingesetzt werden.

This thesis describes the development of a DNA microarray for the detection of cyanobacteria. The array has been applied to the analysis of over 200 water samples from Lake Baikal and Lake Constance. Furthermore this work includes the application of ROC-Analyses for the optimization of genotyping oligonucleotide microarrays. Array probes based on 16S rDNA sequences were developed for the parallel detection of bacteria, cyanobacteria and the potentially toxic genera Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Nodularia, Planktothrix and Cylindrospermopsis. Additional probes were developed for the detection of several species of the genus Synechococcus. The DNA microarray also has the ability to differentiate between toxic and non-toxic Microcystis species via the detection of the mcyA gene, which is involved in the production of hepatotoxic microcystins. Target genes (16S rDNA and mcyA) were simultaneously amplified and fluorescently labelled via duplex PCR, enabling the parallel detection of genus and species alongside assessment of potential toxicity. Before being used for the analysis of environmental water samples, all probes were validated using 30 reference strains in a total of 170 hybridisation experiments. The comparison of different DNA extraction methods and the subsequent optimization of every processing step lead to a very robust detection system. The basic research undertaken during this project led to new and widely applicable methods for the optimization of oligonucleotide probes for genotyping arrays. For all probes a high specificity and sufficient sensitivity could be obtained. The detection limit for Synechococcus species was found to be 2000 cells / ml. Mixed species analysis showed that the toxicity gene mcyA from less than 6200 cells / ml Microcystis viridis could still be detected in a high background (1.3 x 105 cells / ml) of non-toxic cyanobacteria from Lake Baikal. Non-toxic Cyanobacteria of the genus Synechococcus were detected in virtually all water samples taken between 0-30 m depth from Lake Baikal and Lake Constance. Toxic Cyanobacteria were not detected in any of the samples. All results were confirmed by project partners using standard microbiological methods. To optimize the data processing of large array experiments, integrated analysis modules were developed in addition to the ROC-Analysis module, allowing a quick and clear analysis and presentation of the array data. Together with a standardized data-transfer-format, a significant time reduction for array data analysis was achieved. Finally, a portable protocol allowing the use of DNA microarrays on-site during field experiments was established. This was successfully tested on board a research ship at Lake Baikal. In summary, the system described in this thesis proved to be a useful tool for the rapid and robust detection of potentially toxic and non-toxic cyanobacteria in freshwater reservoirs.