Hemmung von Bcr/Abl durch Imatinib führt zu einer Cisplatin-Sensitivierung und zu einer modulierten p53-Funktion bei Bcr/Abl-positiven Zellen

Abstract

Für die Pathogenese der chronisch myeloischen Leukämie (CML) ist die onkogene Kinaseaktivität von Bcr/Abl essentiell. Aufgrund der Tatsache, dass Bcr/Abl selektiv in malignen Zellen exprimiert wird und diese onkogene Tyrosinkinase kausal für die CML ist, stellt dieses Fusionsprotein einen hervorragenden Angriffspunkt für eine zielgerichtete Behandlung der Krankheit dar. Seit der Einführung im Jahr 2001 hat sich der Bcr/Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib Mesylat (Glivec®; GleevecTM; STI571) zum Goldstandard in der Primärtherapie der CML etabliert. Obwohl bisher große therapeutische Erfolge mit Imatinib bei Patienten mit CML in chronischer Phase erzielt werden konnten, ist nach aktuellem Erkenntnisstand keine Eliminierung aller leukämischen Zellen durch eine Imatinib-Monotherapie in Patienten möglich. Die Entwicklung neuer Behandlungs-Strategien, die eine vollständige Heilung der CML erzielt, ist nach wie vor von großer Bedeutung. Erfolgversprechend könnte die Kombination aus Imatinib und anderen Medikamenten, wie zum Beispiel Chemotherapeutika, sein. In der vorliegenden Dissertation gelang erstmalig der Nachweis, dass eine Behandlung mit Imatinib zu einer Hypersensitivität gegenüber Cisplatin führt sowohl bei murinen Bcr/Abl positiven Zellen als auch in primären Philadelphia- positiven Progenitor-Zellen aus CML Patienten, die in diesem Ausmaß bisher nicht beschrieben wurde. Die Kombination aus Imatinib und Cisplatin führte bei Bcr/Abl-positiven Zellen zu einer extrem verstärken Induktion von Zelltod, während dieselbe Behandlung keine zusätzlichen Effekte bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte der durch eine Imatinib/Cisplatin- Behandlung vermittelte Viabilitätsverlust durch eine zusätzliche Inkubation mit dem Mdm2-Antagonisten Nutlin weiter verstärkt werden, sodass im Zellliniensystem ein fast 100 %-iger Zelltod und bei primären Zellen eine fast komplette Hemmung der Koloniebildung erreicht wurde. Interessanterweise ergab ein Vergleich der Cisplatin-Sensitivität der Bcr/Abl-positiven Zelllinie BaF3p185 in Anwesenheit von Imatinib mit der von anderen Tumorzelllinien, dass durch Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen eine Sensitivität erreicht wurde, die vergleichbar mit der extrem sensitiven Hodenzelllinie N-TERA war. Zur Charakterisierung möglicher Ursachen dieser Hypersensitivität Imatinib- behandelter CML Zellen gegenüber Cisplatin, wurden zunächst mögliche Alterationen der Regulation des Zellzyklusarrests nach Cisplatin-Behandlung untersucht. Cisplatin induzierte sowohl bei Bcr/Abl-positiven als auch bei Bcr/Abl-negativen Zellen einen G2/M-Arrest. Durch die Behandlung mit Imatinib kam es zu einem Verlust des G2/M-Arrests und zu einer schnellen Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen, während dieselbe Behandlung keinen Effekt auf den Cisplatin-induzierten G2/M-Arrest bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte mittels einer Analyse der einzelnen Zellgenerationen 24 h nach Cisplatin-Behandlung gezeigt werden, dass Bcr/Abl-positive Zellen bereits nach der ersten Zellteilung in der G2/MPhase arretierten und eine kleine Zellpopulation, vermutlich nach erfolgter Reparatur des DNASchadens, ohne signifikanten Verlust der mitochondrialen Integrität, eine dritte Zellteilung vollendet hatte. In Anwesenheit von Imatinib hingegen waren die Zellen nicht in der Lage in G2/M zu arretieren. Vielmehr kam es bereits nach der ersten Zellteilung zum Verlust der mitochondrialen Integrität infolge von Cisplatin. Es ist bekannt, dass es durch den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials zur Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium und damit zu einem Caspase-abhängigen Todesmechanismus kommt. Interessanterweise verlief der Imatinib/Cisplatin-induzierte Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen unabhängig von Caspasen. Neben Cytochrom C wird auch AIF aus dem Mitochondrium freigesetzt, das in der Lage ist einen Caspase-unabhängigen Todesmechanismus zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es in Bcr/Abl-positiven Zellen infolge einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer AIFTranslokation in den Zellkern und somit zur Induktion von Zelltod kam. Als mögliche Ursache für den Verlust des G2/M-Arrests konnte eine verminderte ATMAktivierung infolge einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung selektiv bei Bcr/Abl-positiven Zellen identifiziert werden. Die verminderte Aktivierung von ATM führte zu einer Reduktion der p53-Phosphorylierung an Serin 15 und zu einer leichten Reduktion der p53-Induktion nach Cisplatin-Behandlung. Die verminderte p53-Phosphorylierung an Serin 15 hatte Konsequenzen auf die durch zellulären Stress hervorgerufene p53-Antwort, wobei es zu einer verminderten transkriptionellen Aktivität von p53 kam. Dies konnte durch die reduzierte Expression der p53-Zielstukturen, Mdm2 und p21, sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene, gezeigt werden. Im Gegensatz zu Mdm2 und p21 waren die proapoptotischen p53-abhängigen Gene wie BAX, PUMA und NOXA bereits in Abwesenheit von zellulärem Stress hoch exprimiert und wurden durch eine Behandlung mit Cisplatin nicht weiter induziert. Auch eine zusätzliche Behandlung der Zellen mit Imatinib hatte keine Auswirkungen auf die Expression von BAX, PUMA und NOXA. Demnach hat p53 auch keine transaktivierende Wirkung auf diese proapoptotischen Gene in diesem Zellsystem nach einer Behandlung mit Cisplatin. Dies bedeutet, dass die Funktion von p53 als Transkriptionsfaktor durch eine Behandlung mit Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen gestört war. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte dennoch gezeigt werden, dass p53 für den hypersensitiven Phänotyp, der bei Bcr/Abl-positiven Zellen durch eine Imatinib/Cisplatin-Behandlung induziert wird, eine entscheidende Rolle spielt. p53 hat neben seiner Funktion als Transkriptionsfaktor im Zellkern auch im Zytoplasma eine wichtige Zelltod-induzierende Funktion. Im Zytoplasma ist p53 in der Lage durch die Bindung an pro- und antiapoptotische Proteine, unabhängig von seiner transkriptionellen Aktivität, BAX zu aktivieren und somit Zelltod zu induzieren. Voraussetzung für die Ausübung dieser Funktion ist eine Lokalisation von p53 im Zytoplasma. In dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass p53 nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung Bcr/Abl-positiver Zellen größtenteils im Zytoplasma akkumuliert. Der p53-Export aus dem Zellkern wird vermittelt durch eine verminderte p53-Phosphorylierung am Serin-Rest an Stelle 15, durch eine niedrige Mdm2-Proteinmenge und durch die Aktivierung von FoxO3a. Alle drei Mechanismen konnten in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Demnach wird die rasche Induktion von Zelltod durch zytoplasmatisches p53 vermittelt. Im Zytoplasma interagiert p53 mit dem antiapoptotischen Protein Bcl-xL, wodurch eine Aktivierung von BAX durch p53 und somit die Induktion von Zelltod verhindert wird. Es konnte gezeigt werden, dass es selektiv bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer signifikanten Reduktion der Bcl-xL-Expression kam. Diese verminderte Expression von Bcl-xL führte wahrscheinlich zu einem Ungleichgewicht zwischen Bcl-xL und p53 zugunsten von p53, sodass vermehrt “freies“ p53 im Zytoplasma vorlag, das dann in der Lage war, BAX zu aktivieren und einen mitochondrialen Zelltod zu induzieren. Die entscheidende Rolle der verminderten Bcl-xL Expression für den hypersensitiven Phänotyp konnte dadurch belegt werden, dass eine exogene Expression von Bcl-xL, die das Gleichgewicht mit p53 wiederherstellte, ausreichend war, um den Verlust der mitochondrialen Membranintegrität und die Translokation von AIF zu verhindern. Die Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung konnte dadurch signifikant reduziert werden. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass für die Induktion einer Tumorselektiven Hypersensitivität gegenüber Cisplatin zwei Signalwege von entscheidender Bedeutung sind. Durch die Hemmung des ATM/p53-Signalwegs sind Bcr/Abl-positive Zellen nicht mehr in der Lage, in der G2/M-Phase zu arretieren. Darüber hinaus vermittelt eine Cisplatin-Behandlung in Anwesenheit von Imatinib die Akkumulation von p53 im Zytoplasma und eine gleichzeitige Reduktion der Bcl-xL-Expression, was zu einer massiven Induktion von Zelltod führt. Die Befunde dieser Arbeit könnten auch für andere maligne Erkrankungen bedeutend sein. Aufgrund der Tatsache, dass bei vielen Tumoren Signalwege der DNA-Schadensprozessierung per se dereguliert sind, könnte die pharmakologische Hemmung eines weiteren Wegs zu einer vergleichbaren Hypersensitivität führen, wie sie in vorliegender Dissertation nach Hemmung der ATM/p53-Achse und der Bcl-xL-Expression beobachtet wurde. Da bei normalen Zellen durch diesen pharmakologischen Eingriff lediglich ein Weg gehemmt würde, der andere jedoch weiterhin intakt wäre, wäre diese Hypersensitivität tumorselektiv.

Chronic myeloid leukemia (CML) is induced by the Bcr/Abl fusion protein. The Bcr/Abl tyrosine kinase is the critical pathogenetic event in CML and therefore an ideal target for therapy. Since 2001 Imatinib mesylate (Glivec®; GleevecTM; STI571) is used as a therapeutic and provides a method to treat CML patients, which is highly effective in inducing remissions in chronic phase CML. However, complete eradication of the malignant clone by Imatinib is rare. Therefore it is necessary to find new strategies that allow a complete elimination of the malignant Bcr/Abl positive clone. One strategy to achieve this aim could be the combination of Imatinib with chemotherapeutic agents such as Cisplatin. The results of the present work show that Imatinib enhances sensitivity to Cisplatin selectively in Bcr/Abl positive cells. Pulse-treatment of primary progenitor cells with 3 μM Imatinib for 16 hours had no significant effect on GM-CFU colony formation of Philadelphia positive or negative myeloid progenitors. This is also true for treatment of these cells with low dose Cisplatin (1 μM) for 16 hours alone. Cisplatin caused a minimal non-significant decrease in total number of colonies developed from Philadelphia positive and Philadelphia negative progenitors, respectively. Co-treatment with Imatinib and Cisplatin had no further effect on normal myeloid progenitors. In contrast, pulse-treatment of CD34+ cells from CML patients with the combination of the 2 compounds for 16 hours produced a significant decrease in the overall number of colonies. Furthermore, this Imatinib mediated sensitivity in Bcr/Abl positive cells could be further augmented by pre-treatment with the Mdm2-antagonist Nutlin. To characterize the extent of sensitivity to Cisplatin reached by pre-treatment with Imatinib, the Cisplatin concentrations necessary for 50 % growth inhibition (GI50 values) of Bcr/Abl positive cells pre-incubated with Imatinib were compared with those observed in a panel of 28 different cancer cell lines, including 3 testicular germ cell tumor (TGCT) cell lines which are known to be highly sensitive to Cisplatin. Remarkably, pre-treatment of Bcr/Abl positive BaF3 cells with Imatinib resulted in a GI50 value comparable to that obtained for the most sensitive TGCT cell line in our panel, N-TERA. Hence, treatment of Bcr/Abl positive cells with Imatinib renders them exquisitely sensitive to the cytotoxic effects of Cisplatin. Furthermore, the results of the present work show that Imatinib treatment shifts the DNA damage response upon Cisplatin from cell cycle arrest to rapid induction of mitochondrial cell death. In the absence of Imatinib, Bcr/Abl positive BaF3 cells responded to Cisplatin treatment with a G2/M arrest. In contrast, pre-incubation with Imatinib led to a significant decrease of the percentage of cells in G2/M phase after addition of Cisplatin at each time point investigated. Tracking of cell divisions by the membrane dye CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) demonstrated that Imatinib-mediated inhibition of Bcr/Abl led to a rapid onset of mitochondrial outer membrane permeability (MOMP) as displayed by a loss in TMRM fluorescence already after a single cell division. This is in sharp contrast to control cells treated with Cisplatin alone. These cells accomplished the first cell division and went into cell cycle arrest in G2/M phase in the second division without significant induction of MOMP. In the absence of Imatinib, a small percentage of the cells was even able to start the third cell division already after 24 hours, again without induction of MOMP. These results indicate that combined treatment of Bcr/Abl positive cells with Imatinib and Cisplatin leads to the induction of a rapid cell death after one single cell cycle division instead of arresting in G2/M phase. MOMP commonly results in cytochrome c release and apoptosome-dependent caspase activation, i.e in the induction of apoptosis. Interestingly, however, the rapid cell death observed in Bcr/Abl positive cells treated with Imatinib and Cisplatin seems to be completely independent of caspase activity, as the pancaspase inhibitor zVAD-fmk had no effect in these cells. It has been reported that in addition to the apoptosome-dependent pathway, mitochondrial cell death can also proceed independently of caspase activation via release of factors tethered to the inner mitochondrial membrane (IMM) such as apoptosis-inducing factor (AIF). In the present work it could be demonstrated that treatment of Bcr/Abl positive cells with Imatinib and Cisplatin led to a translocation of AIF from mitochondria to the nucleus within 16 hours where it acts as a potent inducer of cell death. One reason for the phenomenon that Imatinib treated Bcr/Abl positive cells were not able to arrest in G2/M phase may be an impaired ATM activation upon Cisplatin. Imatinib significantly reduced ATM autophosphorylation upon Cisplatin treatment selectively in Bcr/Abl positive cells. This was mirrored by the observation that in Bcr/Abl positive, but not Bcr/Abl negative cells, Imatinib strongly impeded Cisplatin-induced phosphorylation of p53 on serine 15, a site which is directly phosphorylated by ATM following DNA damage. Importantly, pre-treatment with Imatinib had only a minor effect on p53 protein stabilization upon Cisplatin in these cells. Active Bcr/Abl kinase led to an enhanced activation of p53 as a transcription factor when compared to the corresponding Bcr/Abl negative counterparts as shown by a forced induction of the p53 downstream targets Mdm2 and p21 mRNA and protein upon Cisplatin treatment. However, inhibition of Bcr/Abl by Imatinib led to a significant reduction of p53 transcriptional activity. Both Mdm2 and p21 mRNA and protein-levels were significantly reduced upon Cisplatin treatment in Bcr/Abl positive cells in the presence of Imatinib, whereas the same treatment had no effect on p53 transcriptional activity in the Bcr/Abl negative cells. In contrast to Mdm2 and p21, the proapoptotic p53 targets BAX, PUMA, and NOXA were constitutively highly expressed in non stressed Bcr/Abl positive and negative BaF3 cells. In addition, these genes were not further induced by Cisplatin treatment demonstrating that p53 had no effect on these genes. Furthermore, Imatinib did not alter the expression of these genes neither in the presence nor in the absence of Cisplatin in Bcr/Abl positive cells. These results indicate that the extensive cell death induction observed in Bcr/Abl positive cells treated with Imatinib and Cisplatin is not due to a selective induction of proapoptotic genes by p53. Despite of the reduced activity of p53 as a transcription factor mediated by Imatinib, the data of the present work demonstrate that p53 has an important role for induction of hypersensitivity to Cisplatin. p53 regulates cell death not only as a transcription factor of many genes involved in apoptosis but also acts as a proapoptotic protein in the cytoplasm independent of its transcriptional activity by binding to the anti-apoptotic proteins Bcl-xL and Bcl-2 and promoting BAX activation. A prerequisite for this function of p53 is the localization in the cytoplasm, which is mediated by loss of p53 phosphorylation on serine 15, low Mdm2 levels, and FoxO3a activation. All three mechanisms could be verified in the present work. Therefore, these mechanisms may contribute to the observed predominant accumulation of p53 in the cytoplasm upon treatment with Imatinib and Cisplatin. In the cytoplasm the anti-apoptotic protein Bcl-xL interacts with p53 and thereby prevents p53 from activating BAX and inducing MOMP. In addition, it is a common finding that malignant cells with constitutively active tyrosine kinases have high levels of Bcl-xL and concomitantly are resistant to many DNA damaging agents. Treatment of Bcr/Abl positive BaF3 cells with Imatinib and Cisplatin led to reduced Bcl-xL levels. The role of Bcl-xL was demonstrated by the finding that exogenous expression of Bcl-xL significantly attenuated the induction of MOMP in Bcr/Abl positive cells treated with Imatinib and Cisplatin. As a result, AIF translocation was completely abrogated in cells expressing exogenous Bcl-xL. Consistent with the above observations, transfection with Bcl-xL almost completely abrogated the induction of apoptosis in Bcr/Abl positive cells exposed to Cisplatin after Imatinib pre-treatment. Together, these findings suggest that the downregulation of Bcl-xL may contribute to Cisplatin hypersensitive phenotype. Inhibition of ATM alone was sufficient to prevent G2/M arrest. However, ATM inhibition did not induce a hypersensitive phenotype comparable to that observed with Imatinib. Therefore, dual inhibition of the ATM/p53 axis and reduction of Bcl-xL seems to be required for induction of a hypersensitive phenotype. The findings of this work may also be of great importance for other malignant diseases. Deficiency of one or more signaling pathways involved in DNA damage response mechanisms is a common finding in many tumor entities. Therefore, pharmacological inhibition of one further pathway may lead to a hypersensitive phenotype selectively in the tumor compartment which is comparable to that observed in the present work by inhibiting ATM/p53-axis and Bcl-xL expression.