Charakterisierung einer Familie von Pry-Proteinen in Candida albicans

Abstract

Die Mitglieder der Superfamilie der CAP-Proteine sind ubiquitär verbreitet und zeichnen sich durch eine konservierte zentrale Domäne aus, die ihnen eine außerordentlich stabile drei-dimensionale Struktur verleiht und die den strukturellen Anforderungen extrazellulär wirkender Proteine entspricht. Der Grad der Sequenz- und Strukturhomologien dieser Proteine deutet auf einen ähnlichen Wirkmechanismus hin, die molekulare Funktion der CAP-Proteine ist bis heute jedoch unklar. In dieser Arbeit wurde eine bisher nicht beschriebene Familie von CAP-Proteinen in C. albicans identifiziert und deren Mitglieder funktionell charakterisiert. In Analogie zu S. cerevisiae sollen diese als Pry-Proteine bezeichnet werden (pathogenesis-related in yeast). Die Pry-Proteinfamilie in C. albicans umfasst 5 Mitglieder, die im Zusammenhang mit der Morphogenese von C. albicans (Hefe – Hyphe, white – opaque) differentiell reguliert sind. Alle 5 Familienmitglieder weisen spezifische strukturelle Merkmale sekretierter Proteine auf. Transkriptionelle Studien zeigen, dass die beiden Pry-Proteine Rbe1p und Rbt4p von den zentralen Regulatoren der Morphogenese in C. albicans, Efg1p und Tup1p, gegensätzlich reguliert werden. Dabei wird Rbe1p v.a. in Blastosporen und opaque-Zellen, Rbt4p degegen in Hyphen exprimiert. Die Promotorsequenz von RBE1 umfasst 1039 bp und enthält eine aktivierende und eine reprimierende Domäne für die Transkription. Obwohl diese mehrere mögliche Bindestellen für Efg1p aufweisen, bindet heterolog exprimiertes Efg1p offensichtlich nicht an den RBE1-Promotor, so dass die Regulation von RBE1 voraussichtlich indirekt durch Efg1p erfolgt. Massenspektrometrische Analysen des C. albicans-Sekretoms weisen Rbe1p und Rbt4p als sekretierte Proteine in C. albicans aus. Dabei ist Rbe1p ein spezifisch von Blastosporen sekretiertes Protein, während Rbt4p ein Bestandteil des Sekretoms von Blastosporen und Hyphen ist. Heterolog exprimiertes Rbe1p und Rbt4p zeigen keine für die CAP-Proteine postulierte Funktion als Protease. Deletionsstudien für RBE1 und RBT4 in SC5314 zeigen keinen Phänotyp auf gängigen Labormedien, sowie keine Beteiligung an der Adhäsion und Invasion humanen Epithelgewebes. In Kombination führt die Deletion beider Gene allerdings zu einer starken Attenuation der Virulenz in einem intravenösen Mausmodell für systemische Kandidosen. Diese tritt bei einer Deletion nur eines der beiden PRY-Gene nur schwach zutage, da in diesen Stämmen das jeweils andere PRY-Gen kompensatorisch induziert wird. Dieser synergistische Virulenzphänotyp spricht für eine ähnliche Funktion der beiden Proteine sowie für eine Regulation durch ähnliche Signalwege.

The members of the CAP superfamily of proteins are disseminated in a widespread range of organisms of all kingdoms and are characterized by a conserved central domain that accounts for an extraordinary stable three-dimensional structure, meeting the structural requirements for proteins functioning in the extracellular environment. The PR-1 (pathogenesis-related) subfamily of these proteins has already been described in plants as being expressed in response to challenge with pathogens. The degree of sequence and structural homologies between these proteins points to a similar mode of action, yet the molecular function of the CAP proteins is not known. Based on database searches, we identified a similar family of proteins in C. albicans comprising five members with homology to PR-1 proteins in plants. In addition to RBE1 and RBT4, we could assign three yet not further characterized open reading frames, ORF19.6200, ORF19.2787 as well as ORF19.2336, to this family of proteins. In analogy to S. cerevisiae, the members of this family are termed Pry proteins (pathogenesis-related in yeast). Structurally, all of these proteins dispose of characteristics of secreted proteins. RBE1 is expressed in blastospores and opaque cells and is downregulated in hyphae. On the contrary, RBT4 is upregulated in hyphae compared to blastospores and downregulated in opaque cells. Transcript levels for the other family members are generally low under these conditions. Transcription of RBE1 and RBT4 is repressed by EFG1 and TUP1, respectively, thus accomplishing their morphogenesis-related expression. Mass spectrometric analyses of the C. albicans secretome show that both Rbe1p and Rbt4p are secretory proteins in C. albicans. Rbe1p is secreted specifically by yeast cells, whereas Rbt4p is secreted by both yeast and hyphal cells. Single deletion mutants of RBE1 and RBT4 as well as the corresponding Δrbe1/Δrbt4 double mutant in the clinical isolate SC5314 do not show any obvious phenotype under common morphogenesis-inducing conditions. Moreover, no significant differences were found in in vitro adhesion and invasion assays employing different cellular epithelia in comparison to the wildtype. However, applying a mouse model for disseminated candidiasis, the Δrbe1 and Δrbt4 single deletion strains showed a moderate but significant virulence phenotype. A synergistic effect was observed in the Δrbe1/Δrbt4 double mutant for which virulence was strongly attenuated. Strikingly, RBE1 transcript levels are upregulated in the Δrbt4 mutant strain and vice versa, indicating that both proteins share similar molecular functions or are implicated in similar physiological processes critical for virulence in vivo.