Optimierung der rolling circle amplification für beet curly top Geminiviren und ihre defekten DNAs

Abstract

Weltweit werden Erträge wichtiger Kulturpflanzen durch Infektionen mit Geminiviren gemindert. Daher sind schnelle und sensitive Diagnostikmethoden erforderlich, die erkrankte Pflanzen frühzeitig identifizieren. Alternativ könnte der Anbau resistenter Pflanzen Infektionen eindämmen. DNA-Interferenz wurde erfolgreich in N. benthamiana getestet (Frischmuth et al., 1997a; Stanley et al., 1990; Stenger, 1994). Transgene defekte DNAs (D-DNAs) wurden durch das Elternvirus mobilisiert und reduzierten dessen Replikation einhergehend mit einer Symptomabschwächung. In dieser Arbeit wurde die DNA-Interferenz im wichtigsten Wirt von beet curly top virus, der Zuckerrübe, untersucht. In zwei Infektionsreihen war die Transgen-Mobilisierung mit schweren Symptomen assoziiert. Nicht-transreplizierende Pflanzen oder solche mit spontan gebildeten D-DNAs (Dn-DNAs) wiesen milde Symptome auf. Das Transgen stimmte bis auf den Austausch G2359T mit der erwarteten Sequenz überein und der C4-ORF war funktionell. Da dieses Protein die Hauptdeterminante für Symptome ist, wurde es als Ursache für die starken Symptome in transgen-positiven Pflanzen vermutet. 20 Dn-DNAs aus fünf Pflanzen (14 bzw. 20 Monate nach Inokulation) wurden sequenziert. Die Moleküle (1340 bis 2810 Nukleotide) waren variabel hinsichtlich ihrer Deletionen. Bei Punktmutationen gab es die Präferenz für C:G->A:T (42 % der Austausche). Durchschnittlich betrug die Mutationsrate 3,3x10-3 Austausche pro Nukleotid. In vier Dn-DNAs traten Inversionen auf, bei 50 % der Moleküle kam es zu Duplikationen. Für eine schnellere Geminivirusdiagnostik wurden Versuche zur Entwicklung eines Mikrochips durchgeführt. Als geeignete Detektionsmethoden erwiesen sich der Einbau Biotin-markierten dUTPs während der Amplifikation und eine Anfärbung des Amplifikates mit SybrGold® und DAPI. Spezifische Oligonukleotide konnten auf planare und sphärische Oberflächen gebunden werden, Hybridisierung geminiviraler DNA und/oder deren Amplifikation auf der Oberfläche fanden jedoch nicht statt. Es wurde gezeigt, dass die Φ29-DNA-Polymerase einige geminivirale DNA-Formen als Matrize nutzen kann, ohne dass Primer in der Reaktionslösung enthalten sind. Vorbehandlungen der Gesamtnukleinsäuren mit zwei Exonukleasen und RNase H vor RCA erlaubten interessante Einblicke in die molekulare Struktur der replikativen Intermediate. Diese Analyse ergänzt die Charakterisierung der Replikation von Geminiviren durch zweidimensionale Gelelektrophorese und Southern blot-Analyse.

Geminiviruses reduce yields of important staple crops worldwide. This necessitates fast and sensitive diagnostics to identify infected plants, at an early stage. Alternatively, resistant plants could help to prevent infections. DNA interference was tested successfully for some geminiviruses in N. benthamiana (Frischmuth et al., 1997a; Stanley et al., 1990; Stenger, 1994). Transgenic defective DNAs (D-DNAs) were mobilized through the parental virus and reduced its replication resulting in an attenuation of symptoms. In the scope of this thesis, DNA interference was investigated in the most important host of beet curly top virus, namely sugarbeet. Two infection series showed that the transgene-mobilization correlated with severe symptoms. Non-transreplicating plants or such with spontaneously formed D-DNAs (Dn-DNAs) developed mild symptoms. The sequence of the transgene was identical to the expected sequence except the nucleotide substitution G2359T. Furthermore, the C4 ORF was functional. As this protein is the main determinant for symptoms, we postulated a correlation with the appearance of severe symptoms in transreplicating plants. Twenty Dn-DNAs from five plants (14 or 20 months post inoculation) were sequenced. The molecules (1340 to 2810 nucleotides) were highly variable regarding their deletions. Amongst the pointmutations, C:G->A:T was predominant (42 % of all changes). The average mutation rate was 3.3x10-3 substitutions per nucleotide. Four Dn-DNAs showed inversions and 50 % of the molecules carried duplications. Experiments were performed to develop a microchip for fast geminivirus diagnostics. Suitable detection methods turned out to be the integration of biotin labelled dUTP during amplification and staining of the amplificate with SybrGold® or DAPI. Specific oligonucleotides could be attached to planar or spherical surfaces. Hybridization of geminiviral DNA and/or its amplification on the surface were not successful. It was shown that some geminiviral DNA forms were amplified by Φ29 DNA polymerase without addition of primers to the reaction. Pretreatments with two exonucleases and RNase H gave interesting insights into the molecular structure of replicative intermediates. This analysis provides additional information about the replication of geminiviruses in combination with twodimensional gelelectrophoresis and Southern blot analysis.