ER-associated protein degradation (ERAD): an unexpected function of Yos9 and the discovery of Mnl2, a new component of the pathway

Abstract

In eukaryotes, membrane and soluble secretory proteins are synthesized at the rough endoplasmic reticulum (ER). A protein that cannot fold properly will be degraded in a process called ER associated degradation (ERAD). Failures in ERAD either by loss of function or by premature degradation of proteins cause a range of severe diseases in humans. In 1989 the gene responsible for the human disease cystic fibrosis (CF), cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), encoding a chloride channel was found. The mutation ΔF508 present in 80% of the patients provokes the most severe symptoms and shortest life expectancy. The disease is a consequence of the accelerated degradation of the protein CFTRΔF508, which never reaches its site of action. Moreover, wild type CFTR has a 25% success in reaching its final destination. Is of great value to understand the ERAD of CFTR and CFTRΔF508 in order to understand the disease. Many components involved in ERAD of these substrates had been discovered. The first part of this work involves a systematic study of human CFTR degradation in yeast (the turnover of CFTR in yeast cells behaves like CFTRΔF508 in human cells). All components examined were found not to be required for CFTR ERAD or had a very mild effect. The ER protein quality control recognizes misfolded proteins in two ways: via exposure of hydrophobic patches on the surface of a protein and modification of its glycan structure. The majority of the proteins that enter the ER are N-glycosylated. During folding of a protein, several enzymes trim these glycan trees generating a degradation signal, which is recognized by the lectin Yos9. There is little known about proteins that enter the ER but are not glycosylated. The second part of the work refers to findings that shed light onto the differences between glycosylated and non-glycosylated substrates in ERAD. To define the ERAD pathway for non-glycosylated proteins, ERAD deficient mutants were checked in their capacity to deliver a non-glycosylated protein for elimination. It is shown that unglycosylated CPY* (CPY*0000) is degraded by the same pathway as is glycosylated CPY* (ERAD-L). However, the Yos9 protein, known to be the recognition component of glycosylated misfolded proteins in ERAD, is shown in this work to have a tuning role in the ERAD of unglycosylated CPY*0000. Yos9 promotes degradation of glycosylated substrates while it hinders degradation of unglycosylated CPY*0000. Additional ERAD components are still to be discovered. In this work a putative mannosidase was found. This protein was named mannosidase like protein 2 (Mnl2). Mnl2 accelerates CPY* degradation. The effect of the deletion of MNL2 is most notable when its homologue MNL1/HTM1 is absent. Substrate degradation in the deletion strain is affected because the glycan structure on the ERAD substrate is no longer a degradation signal. This section of the work introduces a novel ER quality control component involved in glycan trimming.

In eukaryotischen Zellen werden Membranproteine und lösliche Proteine des sekretorischen Weges an dem rauhen Endoplasmatischen Reticulum (ER) synthetisiert. Proteine, die sich im Folgenden nicht korrekt falten, werden in einem Prozess abgebaut, der als ER assoziierte Degradation (ERAD) bezeichnet wird. Störungen des ERAD-Prozesses - dazu zählen leichte Beeinträchtigungen des Abbaus, ein vollständiger Abbaustopp von Substraten sowie auch ein vorzeitiger Abbau - führen beim Menschen zu einer Vielzahl von Erkrankungen. Im Jahre 1989 konnte ein Gen identifiziert werden, dessen Mutation für die Erkrankung Mukoviszidose verantwortlich ist. Dieses Gen codiert für das Protein CFTR (engl. für ‚cystic fibrosis transmembrane conductance regulator’), welches einen Chloridkanal in bestimmten Zelltypen ausbildet. Die Mutation ΔF508, die bei 80% der Erkrankungen auftritt, führt zu einer sehr kurzen Lebenserwartung und zu schwerwiegenden körperlichen Symptomen bei einem Erkrankten. Die Konsequenz der Mutation ist ein vollständiger Abbau des Proteins CFTRΔF508. Bereits von dem Wildtyp-CFTR Protein erreichen lediglich 25% der exprimierten Proteine den eigentlichen Wirkungsort, die Plasmamembran. Die Aufklärung der Vorgänge im ERAD, im Besonderen des Unterschieds zwischen dem Abbau von Wildtyp-CFTR und mutiertem CFTR, ist für die Entwicklung einer effektiven Behandlungsmethode der Mukoviszidose von großer Bedeutung. Es wurden bereits verschiedene Komponenten identifiziert, die im ERAD von CFTR eine Rolle spielen. Der erste Teil dieser Arbeit beinhaltet eine systematische Analyse des Abbaus von humanem CFTR in Hefe (humanes Wildtyp-CFTR verhält sich in Hefe wie CFTRΔF508 in humanen Zellen). Alle hier untersuchten Komponenten zeigten keinen bzw. lediglich einen geringen Einfluss auf die Degradation von CFTR. Prizipiell erkennt die Qualitätskontrolle des ER fehlgefaltete Proteine anhand von zwei Faktoren, der Exposition hydrophober Bereiche und einer modifizierten Glycanstruktur. Die Mehrzahl der Proteine, die das ER durchlaufen, wird mittels N-Glykosylierung modifiziert. Während des Faltungsprozesses von Glycoproteinen trimmen verschiedene Enzyme die Glycane der Proteine. Abhängig von der Faltungsdauer können dabei Glycanstrukturen entstehen, die von dem Lectin Yos9 erkannt werden und als Degradationssignal dienen. Über die ER assoziierte Degradation unglycosylierter Proteine ist bisher nur wenig bekannt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit Befunden, die den Unterschied zwischen glykosylierten und unglykosylierten ERAD-Substraten aufzeigen. Um den Degradationsprozess unglykosylierter Proteine zu spezifizieren, wurden ERAD defiziente Hefestämme auf ihre Funktionalität getestet, diese Substratklasse abzubauen. Dabei stellte sich heraus, dass auch die unglykosyllierte CPY*0000 dem Abbauweg folgt, dem auch die glykosylierte CPY* unterliegt (ERAD-L). Überraschend war allerdigns, dass das Lectin Yos9, das für die Erkennung von fehlgefalteten, glycosylierter Proteinen notwendig ist, auch Einfluss auf die Degradation von unglykosylierter CPY* (CPY*0000) hat. Es konnte gezeigt werden, dass Yos9 den Abbau von glykosylierten Proteinen begünstigt, während der Abbau von CPY*0000 durch Yos9 verzögert wird. Es werden kontinuierlich neue Komponenten des ERAD gesucht. In dieser Arbeit konnte eine mögliche Mannosidase identifiziert werden, die hier als Mnl2 (engl. für ‚mannosidase like protein 2’) benannt wurde. Mnl2 führt zu einem beschleunigten CPY* Abbau. Der Einfluss der MNL2 Deletion auf die Degradation von CPY* wird besonders deutlich, wenn zuvor bereits MNL1 deletiert wurde. Die Substratdegradation ist dann beeinträchtigt, weil die Glycanstruktur des ERAD-Substrats nicht länger als Abbausignal dient. In diesem letzen Teil der Arbeit wird Mnl2 als neue Komponente der ER Qualitätskontrolle vorgestellt, die die Glykanmodifizierung beeinflusst.