Funktionelle Charakterisierung und in silico-Modellierung LPS-induzierbarer Elemente des RANTES-Promotors in humanen Monocyten

Abstract

Das proinflammatorische CC-Chemokin RANTES kann von einer Vielzahl von Geweben als Reaktion auf entsprechende Stimuli produziert werden. Die gewebespezifische Transkription ergibt sich aus der räumlichen Anordnung verschiedener cis-regulatorischer Elemente in der Promotorsequenz und der Anwesenheit von bestimmten Transkriptionsfaktoren. Humane Monocyten produzieren RANTES konstitutiv in geringen Mengen. Stimulation mit LPS führte in diesem Zelltyp zu einer schnellen und transienten Verstärkung der RANTES-Transkription. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Regionen untersucht, die an dieser Transkriptionsaktivierung beteiligt sind. Die Elemente wurden mit Hilfe von DNase I footprinting-Analysen und EMSA-Experimenten, sowie der transienten Transfektion von Reportergenkonstrukten charakterisiert. Die Region E des RANTES-Promotors (R(E), -125/-99) zeigte in den Monocyten-Zellinien MM6 und THP-1 konstitutive Bindung von Mitgliedern der C/EBP-Familie. Die Mutation der C/EBP-Bindungssequenz in R(E) führte in beiden Zelltypen zu einer um 40-50 % verminderten LPS-induzierten Reporteraktivität. Die Region R(AB) (-73/-34) besteht aus den NF-kB-ähnlichen Elementen R(A) und R(B). Diese beiden Elemente bilden zusammen ein LPS-induzierbares Promotor-Modul. R(A) bindet konstitutiv Sp1 und, nach Stimulation mit LPS, Rel-p50/p65-Heterodimere. Beide Faktoren können an R(A) transkriptionsaktivierend wirken. Für die Stimulation der RANTES-Transkription durch LPS ist zusätzlich das induzierte Binden von Rel-p50/p50-Homodimeren an R(B) erforderlich. Die experimentell gewonnenen Daten wurden verwendet, um eine Reihe von Computermodellen zu erstellen. Diese Modelle sollten die Grundstruktur einer durch LPS regulierbaren Promotorsequenz beschreiben. Mit Hilfe dieser Modelle konnten in Datenbanksequenzen andere Promotorbereiche gefunden werden, die ebenfalls durch LPS reguliert werden können. Ferner wurden Kandidatengene für eine transkriptionelle Regulation durch LPS identifiziert.

The chemokine CCL5/RANTES is a proinflammatory agent produced by a variety of tissues in response to specific stimuli. The tissue-specific transcription of CCL5/RANTES is regulated in part by the spatial organization of different cis-acting elements within its promoter and select induced and constitutive transcription factors. In human monocytes, CCL5/RANTES transcription is rapidly and transiently upregulated in response to LPS. In this work two regions are described that help control LPS driven transcription from the human CCL5/RANTES promoter in monocytic cells. These sites were analyzed using DNase I footprinting, transient transfection assays, site-directed mutagenesis and EMSA. RANTES site E (R(E), -125/-99) constitutively binds C/EBP proteins in monocytic Mono Mac 6 and THP-1 cells. Mutation of region R(E) led to a significant (40-50 %) reduction in LPS induced promoter reporter activity. Region R(AB) is composed of tandem kB-like elements R(A) and R(B) (-73/-34). These sites working in concert act as an LPS responsive promoter module. R(A) constitutively binds Sp1, and Rel p50/p65 following LPS stimulation. Either factor can mediate transcriptional effects at R(A). Induced Rel p50/p50 binding to site R(B) is required for LPS regulation of CCL5/RANTES transcription. A series of computer models based upon the CCL5/RANTES promoter were generated to represent the organization of these functional elements. The models were able to identify LPS regulated promoters in human, other vertebrate and viral sequences in various databases.