Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von RERE, einem Gen mit möglicher Relevanz bei der Tumorentstehung

Abstract

RERE (RE repeats encoded) ist ein kürzlich beschriebenes Gen welches in der distalen Region von Chromosom 1p lokalisiert ist. Für diese genomische Region wurde durch molekularbiologische und zytogenetische Studien eine konsistente strukturelle Veränderung in verschiedenen menschlichen Tumoren nachgewiesen. Die Neuroblastom Zelllinie NGP enthält eine reziproke chromosomale Translokation/Duplikation in dieser genomischen Region. Die genomische Sequenz von RERE wurde als die den Bruchpunkt überlagernde Sequenz in der Zelllinie NGP nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die genomische Struktur von RERE beschrieben und die cDNA einer neuen RERE Splicevariante isoliert. In allen untersuchten humanen Geweben wurden mittels Northern blotting zwei dominante RERE-Transkripte nachgewiesen und diese als mögliche Splice Varianten identifiziert. Darüber hinaus wurde in allen untersuchten Tumorzelllinien mittels Western blotting zwei dominante Proteinbanden mit einem RERE Immunserum nachgewiesen. In 2 von 18 untersuchten Tumorzelllinien wurde zusätzlich jeweils eine kleinere dominante Proteinbande detektiert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß überexprimiertes RERE in PML Oncogenic Domains (PODs) lokalisiert ist und mit den pro-apoptotischen Proteinen PML, BAX und mit Mitochondrien kolokalisiert. Bei RERE transfizierten Zellen wurde durch unterschiedliche Methoden Apoptose nachgewiesen. Durch die Untersuchung verschiedener RERE Proteinfragmente (gesamtes RERE und N- oder C-terminale Deletionsmutanten von RERE) konnte die Region beschrieben werden, die eine Kolokalisierung von RERE und PODs unterstützt und nachdem sie in verschiedene Zelllinien transfiziert wurde, mit dem Nachweis von Apoptose korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben einen ersten Hinweis auf die Funktion von RERE. RERE könnte eine Verbindung zwischen PODs und der Kontrolle von Apoptose darstellen und somit eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielen.

RERE (RE repeats encoded), a novel gene that was recently described is located to the distal region of chromosome 1p. In this genomic region, molecular and cytogenetic studies have unveiled frequent structural rearrangements in several human malignancies. The neuroblastoma cell line NGP contains a reciprocal chromosomal translocation/duplication which maps within this genomic region. The genomic sequence of RERE was recently identified to span this reciprocal translocation/duplication breakpoint in the cell line NGP. In this work the genomic structure of RERE was described and a new splice variant of RERE was isolated. Northern blots with poly (A)+ RNA revealed signals of two dominant transcripts in all investigated human tissues that were identified as splice variants. Western blot analysis revealed two protein species in whole protein lysates of 18 tumor cell lines. The first evidence that RERE protein expression varies in tumor cell lines was the detection of additional smaller RERE-specific protein species in two of this tumor cell lines. In this work it is further shown that RERE was detected to localized to PML Oncogenic Domains and colocalizes with the pro-apoptotic proteins PML, BAX and with mitochondria. It is shown that apoptosis was induced after RERE transfection. The investigation on the cellular localization of various RERE protein products (full length RERE and N- or C-terminal deletion mutants of RERE) add further information on which regions of RERE enhance localization to PODs. These findings shed considerable light on the function of RERE which may provide an important link between the role of PODs in the control of apoptosis and tumorigenesis.