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Autor(en): Scazzari, Mario
Titel: Cytosolic protein quality control of the orphan protein Fas2, a novel physiological substrate of the E3 ligase Ubr1
Sonstige Titel: Cytosolische Proteinqualitätskontrolle des Orphanproteins Fas2, ein neues physiologisches Substrat der E3 Ligase Ubr1
Erscheinungsdatum: 2013
Dokumentart: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-85929
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1410
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1393
Zusammenfassung: Cellular protein quality control (PQC) monitors the proper folding of polypeptides, assembly of protein subunits into protein complexes as well as the delivery of terminally misfolded proteins to degradation. The components of PQC known best at the moment are molecular chaperones and the ubiquitin proteasome system. In contrast to the well-described protein quality control system of the endoplasmic reticulum (ERAD), less is known about how misfolded proteins in the cytosol are recognized and degraded. The cytosolic fatty acid synthase complex (FAS) of Saccharomyces cerevisiae, which is composed of six Fas1- and six Fas2-subunits, is rather stable to proteolysis in vivo. In the absence of the Fas1 subunit (FAS1 deletion strain) the remaining Fas2 subunit becomes an orphan protein which is proteolytically unstable and is targeted to the 26S proteasome for degradation (Egner et al, 1993). In my work, I used the orphan Fas2 protein as object of investigation in order to identify new cellular components that are involved in the recognition and degradation of a natural unassembled protein subunit in S. cerevisiae. In addition, it was elucidated how these newly identified factors act in the quality control process of a naturally occurring orphan protein. Due to previous reports (Heck et al, 2010; Prasad et al, 2010) showing that some cytosolic misfolded proteins are imported into the nucleus for proteasomal degradation the cellular localization of orphan Fas2 was determined. Using laser-scanning microscopy it could be shown that C-terminally EGFP-tagged (enhanced green fluorescent protein) orphan Fas2 is localized to the cytosol, thus representing a potential substrate for the cytosolic quality control system (CytoQC). Furthermore, glycerol step density gradient centrifugation experiments revealed that the majority of the orphan Fas2 proteins are organized in high molecular assembly intermediates, which consist mostly of Fas2 homohexamers. By using the thermosensitive ssa1-45 mutant carrying in addition the gene deletions of SSA2, SSA3 and SSA4, it could be shown that the proteasomal degradation of the orphan protein is dependent on the Hsp70 chaperone Ssa1. It is likely that Ssa1 is required for keeping orphan Fas2 soluble. All members of the Hsp90-, Hsp100-, and Hsp110-chaperone family as well as the small heat shock proteins Hsp26 and Hsp42 were shown to have no effect on the degradation of orphan Fas2. Selected members of the Hsp40 chaperone family, including Apj1, Xdj1 and even Ydj1 also did not show a significant influence on the Ssa1-dependent elimination of the substrate. To prove whether other components of the UPS than the proteasome are required for degradation of orphan Fas2 different E2- and E3 gene deletion mutants were analyzed. It was found that the elimination of orphan Fas2 is strongly delayed in a strain carrying a UBC2 UBC4 double deletion. As single deletions of UBC2 and UBC4 have no significant effect on the turnover of the substrate, it can be assumed that these E2 enzymes have complementing functions in the degradation process of orphan Fas2. In a search for the responsible E3 ubiquitin ligase(s) required for orphan Fas2 degradation the E3 RING ligase Ubr1 was identified. Deletion of UBR1 leads to a strongly delayed degradation of orphan Fas2. The expression of an Ubr1 RING mutant (C1220S) or of an Ubr1 type-1 N-end rule mutant (D176) from a high-copy plasmid in the UBR1 deletion strain cannot complement the strongly delayed degradation of orphan Fas2. In contrast, the stabilization of the orphan protein in the UBR1 deletion strain is reversed, when the same strain harbours a high-copy plasmid expressing wild type Ubr1 or an Ubr1 type-2 N-end rule mutant (P406S) or even a cytosolically-located version of the nuclear E3 RING ligase San1 due to deletion of the nuclear localization sequence. Interaction studies revealed that the E3 RING ligase Ubr1 is physically associated with orphan Fas2. In addition, it was found that Ubr1 mutants harbouring either a defect RING domain or a defect in one of the N-end rule substrate-binding sites (type-1 or type-2) were still able to physically interact with orphan Fas2. Further studies showed that the physical association of orphan Fas2 and Ubr1 remains stable in the conditional ssa1-45 mutant carrying in addition deletions of SSA2 to SSA4. This indicates that already E3-bound orphan Fas2 may not require a functional peptide-binding domain of Ssa1 to maintain the physical contact to Ubr1. Finally, the AAA-ATPase Cdc48 was identified to be necessary for the elimination process of orphan Fas2. Cdc48 may function in the dissociation process of orphan Fas2 assembly intermediates, which mainly consist of Fas2-homohexamers.
Die zelluläre Proteinqualitätskontrolle überwacht die korrekte Faltung von Polypeptiden, die Assemblierung von Proteinuntereinheiten in Proteinkomplexen sowie den Abbau von irreversibel fehlgefalteten Proteinen. Die molekularen Chaperone und das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) sind die derzeit am Besten bekanntesten Komponenten der zellulären Proteinqualitätskontrolle. Im Gegensatz zu dem gut untersuchten Proteinqualitätskontrollsystem des Endoplasmatischen Retikulums (ERAD) ist relativ wenig über die Erkennung und den Abbau von fehlgefalteten Proteinen im Cytosol bekannt. Die cytosolische Fettsäuresynthase (FAS) von Saccharomyces cerevisae, welche aus sechs Fas1- und sechs Fas2-Proteinuntereinheiten besteht, ist ein in vivo proteolytisch stabiler Enzymkomplex. In Abwesenheit der Fas1 Untereinheit (FAS1 Deletion) wird die verbleibende Fas2 Untereinheit zu einem Waisenprotein (Orphanprotein), welches proteolytisch instabil ist und durch das 26S Proteasom abgebaut wird (Egner et al, 1993). In meiner Arbeit habe ich Orphan Fas2 als Untersuchungsobjekt benutzt, um weitere zelluläre Komponenten der cytosolischen Proteinqualitätskontrolle zu identifizieren, die an der Erkennung und am Abbau einer natürlichen und nicht-assemblierten Proteinuntereinheit in S. cerevisiae beteiligt sind. Des Weiteren sollten die genauen Funktionen der neu entdeckten Komponenten im Qualitätskontrollprozess dieses natürlich vorkommenden Orphanproteins bestimmt werden. Aufgrund vorheriger Berichte (Heck et al, 2010; Prasad et al, 2010), welche zeigen, dass der proteasomale Abbau einiger cytosolischer, fehlgefalteter Proteine im Zellkern stattfindet wurde zunächst die zelluläre Lokalisation von Orphan Fas2 bestimmt. Mittels Laser Scanning Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass Orphan Fas2-EGFP (enhanced green fluorescent protein) gleichmäßig im Cytosol der Bäckerhefe lokalisiert ist und somit ein potentielles Substrat der Cytosolischen Proteinqualitätskontrolle (CytoQC) darstellt. Unter Verwendung der Dichtegradientenzentrifugation stellte sich heraus, dass die meisten Orphan Fas2 Proteine in hochmolekularen Assemblierungs-intermediaten vorliegen, die wiederum hauptsächlich aus Fas2 Homohexameren bestehen. Mit Hilfe der temperatursensitiven ssa1-45 Mutante, in der zusätzlich alle weiteren SSA Gene (SSA2, SSA3, SSA4) deletiert sind, konnte gezeigt werden, dass der proteasomale Abbau von Orphan Fas2 vom Hsp70 Chaperone Ssa1 abhängig ist. Man kann davon ausgehen, dass Ssa1 bei der Aufrechterhaltung der Löslichkeit von Orphan Fas2 eine wichtige Rolle spielt. Alle Mitglieder der Hsp90-, Hsp100- und der Hsp110-Chaperone Familie sowie die kleinen Hitzeschockproteine, Hsp26 und Hsp42, haben dagegen keinen Einfluss auf den Abbau des Orphan Substrats. Ausgewählte Mitglieder der Hsp40 Chaperone Familie, einschließlich Apj1, Xdj1 und sogar Ydj1, haben ebenso keinen Effekt auf die Ssa1-abhängige Eliminierung von Orphan Fas2. Um zu prüfen ob neben dem Proteasom noch weitere Komponenten des UPS am Abbau des Fas2 Orphanproteins beteiligt sind wurden diverse E2 und E3 Deletionsmutanten getestet. Der Abbau von Orphan Fas2 ist in einem UBC2 UBC4 Doppeldeletionsstamm stark verzögert. Da die jeweiligen Einzeldeletionen von UBC2 und UBC4 keinen signifikanten Effekt auf den Abbau des Substrats haben, kann man davon ausgehen, dass diese beiden E2 Enzyme komplementierende Funktionen im Bezug auf den Abbau von Orphan Fas2 besitzen. Bei der Suche nach entsprechenden E3 Ubiquitin Ligasen, die an der Qualitätskontrolle des Fas2 Orphanproteins beteiligt sind, konnte die E3 RING Ligase Ubr1 identifiziert werden. Eine Deletion von UBR1 führt zu einem stark verzögerten Abbau des Substrats. Die Expression einer Ubr1 RING Mutante (C1220S) oder einer Ubr1 Type-1 N-end Rule Mutante (D176E) von einem High-copy Plasmid in einem UBR1 Deletionsstamm hatte keinen Einfluss auf den stark verlangsamten Abbau von Orphan Fas2. Im Gegensatz dazu wird die Stabilisierung von Orphan Fas2 in einem UBR1 Deletionsstamm wieder aufgehoben wenn dieser gleichzeitig ein High-copy Plasmid enthält welches entweder Wildtyp Ubr1, eine Ubr1 Type-2 N-end Rule Mutante (P406S) oder eine cytosolisch-lokalisierte Variante der nukleären E3 RING Ligase San1 (San1 ohne Kernlokalisierungssequenz) exprimiert. Interaktionsstudien haben gezeigt, dass die E3 RING Ligase Ubr1 mit Orphan Fas2 physikalisch assoziiert ist. Es hat sich weiterhin herausgestellt, dass Ubr1 Mutanten, die entweder eine defekte RING Domäne (C1220S) oder eine Mutation in einer der N-End Rule Substratbindestellen (D176E oder P406S) besitzen, immer noch in der Lage sind mit Orphan Fas2 zu interagieren. Ergebnisse weiterer Bindungsstudien konnten außerdem darlegen, dass zumindest eine bereits bestehende physikalische Interaktion zwischen Orphan Fas2 und Ubr1 in der temperatursensitiven ssa1-45 Mutante, in der zusätzlich alle weiteren SSA Gene (SSA2, SSA3, SSA4) deletiert sind, bestehen bleibt. Schließlich wurde die AAA-ATPase Cdc48 als ein weiterer wichtiger Faktor für den Abbau von Orphan Fas2 identifiziert. Cdc48 ist wahrscheinlich an der Dissoziation von Fas2 Assemblierungsintermediaten, welche hauptsächlich aus Fas2 Homohexameren bestehen, beteiligt.
Enthalten in den Sammlungen:03 Fakultät Chemie

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