miRNAs in control of oncogenic signaling in breast cancer cells

Abstract

microRNAs (miRNAs) are 17-nt to 24-nt short non-coding RNAs that have emerged as criti-cal regulators of gene expression in almost all forms of life. miRNAs act by partial comple-mentary binding usually within the 3’-untranslated region (3’UTR) of the mRNA target result-ing in translational repression and/or mRNA degradation. Microarray and proteomic experi-ments have demonstrated the impact of a single miRNA on fine-tuning expression of a hun-dred of targets affecting a multitude of biological processes such as development, prolifera-tion and apoptosis. Deregulation of miRNA function is also implicated in various diseases including the development of cancer. Furthermore, recent miRNA profiling studies conducted on different tumor types have identified sets of miRNAs that have altered expression in tumor and normal tissue, making them attractive targets for therapeutic intervention or as diagnostic markers. Nevertheless, target identification and detailed knowledge of miRNA functions is the key for the correct selection of miRNAs causally involved in the specific disease process. This thesis focuses especially on the role of miRNAs in two processes that are of major in-terest to breast cancer research; the ErbB2/ErbB3/Akt signaling pathway and cancer cell motility. Prolonged ErbB2/ErbB3/Akt signaling is frequently reported in various cancers and enables the cell to bypass targeting therapies as it favors cell survival. In the case of breast cancer, this is particularly achieved by increased ErbB2/ErbB3 receptor activation. In order to investigate the extent by which miRNAs modulate the ErbB receptor signaling pathway, we performed a genome-wide screen in the breast cancer cell line MCF7 based on Akt phos-phorylation as a read-out. We identified 43 miRNAs that specifically regulate heregulin (HRG)-induced Akt activation, either positively or negatively, and revealed the complexity of coordinated miRNA-target interactions within the ErbB signaling pathway. We further validat-ed four miRNAs, miR-149, miR-148b, miR-326, and miR-520a-3p, with potential tumor sup-pressive function as novel regulators of ErbB3 transcript and protein levels. But also the ex-pression levels of other key components within the ErbB/Akt pathway were affected either on the protein or mRNA level, like Erk1/2 and PIK3CA. The selected miRNAs further efficiently blocked ErbB signaling and HRG-dependent proliferation, supporting their tumor-suppressive role. In the second part, we focused on the role of the screen hit miR-149 in regulating cancer cell motility, a process that is of pivotal importance for the formation of metastasis especially in later stages of breast cancer. Clinical data revealed that miR-149 is downregulated in various tumor types, including the basal-like breast cancer subtype. Using the basal-like MDA-MB-231 cell line as a model system and a combination of biochemical and cellular as-says, we showed that miR-149 interfered with signaling downstream of integrin receptors at multiple levels, impairing Rac activation and efficiently blocking cell migration and invasion both in vitro and in vivo. Furthermore, Rap1a, Rap1b and Vav2 were identified as potential targets of miR-149. In addition, we confirmed the observed phenotype in other basal-like breast cancer cell lines, therefore providing evidence that miR-149 has broader tumor-suppressive function. Taken together, this study demonstrates a new role for several miRNAs in regulating cancer-associated pathways and further broadens our knowledge of their functions.

microRNAs (miRNAs) sind 17 – 24 nt kurze, nicht-kodierende RNAs, welche einen wesentli-chen Beitrag zur Genregulation in nahezu allen Lebewesen ausüben. Durch die Anbindung an die entsprechende Ziel-mRNA können miRNAs entweder die mRNA Degradation imitieren oder die mRNA Translation reprimieren. Dabei erfolgt die Bindung über eine möglichst komplementäre Basenpaarung der miRNA mit der untranslatierten 3’-Region der Ziel-mRNA. Protein- und RNA-basierte Analysen haben gezeigt, dass eine miRNA die Expression von hunderten von Genen beeinflussen kann. Dementsprechend sind miRNAs auch in der Regu-lation von nahezu allen biologischen Prozessen involviert, wie zum Beispiel bei der Zellent-wicklung, der Proliferation und der Apoptose. Allerdings ist die Funktion einiger miRNAs auch eng mit verschiedenen Krankheiten wie Krebs verknüpft, und etliche Studien haben bereits deutlich veränderte Expressionsraten einiger miRNAs in den Expressionsprofilen von gesunden und kanzerogenen Geweben gezeigt. Dies veranschaulicht nicht zuletzt die hohe Relevanz von miRNAs für die Anwendung als Biomarker beziehungsweise für den Einsatz als Therapeutikum. Allerdings erfordert eine erfolgreiche klinische Anwendung von miRNAs die Identifikation relevanter Zielgene sowie eine detaillierte Aufklärung der biologischen Funktionen und beteiligten Prozesse. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von miRNAs in zwei Prozessen, die wesentlich zur Entstehung von Brustkrebs beitragen. Dabei handelt es sich zum einen um den ErbB2/ErbB3/Akt-Signalweg und zum anderen um die Zellmotilität von Krebszellen. Eine er-höhte Aktivität des Akt-Signalwegs ist eng mit der Entstehung von therapieresistenten Krebszellen verbunden, da Akt das Überleben der Zellen unterstützt. In Brustkrebszellen wird dies häufig durch eine erhöhte Aktivität des ErbB2/ErbB3-Rezeptors hervorgerufen. Ba-sierend auf der heregulininduzierten Akt-Phosphorylierung wurde ein genomweiter miRNA-Screen in der luminalen Brustkrebszelllinie MCF7 durchgeführt. Dabei wurden 43 miRNAs identifiziert, welche signifikant die heregulininduzierte Akt-Phosphorylierung positiv oder ne-gativ regulierten. Die bioinformatische Analyse lieferte einen ersten Hinweis auf das komple-xe Zusammenspiel der miRNA und deren potentieller Zielgene im ErbB-Signalweg, wobei für die vier ausgewählten miRNAs, miR-148b, miR-149, miR-326 und miR-520a-3p, die Negativ-Regulation von ErbB3 auf Transkript und Protein-Ebene experimentell bestätigt wurde. Aber auch andere Komponenten des ErbB-Signalweges, wie Erk1/2 oder PIK3CA, wiesen ein deutlich reduziertes Protein- oder mRNA Level auf. Die tumorsuppresiven Eigenschaften dieser miRNAs wurden ferner gestützt durch die verminderte Aktivität des ErbB-Signalweges und der inhibierten heregulinabhängigen Proliferation der MCF7-Brustkrebszellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde vor allem die Rolle von miR-149 in der Regulation von Zell-motilität behandelt, welche ein entscheidender Faktor bei der Entstehung von Metastasen ist. Klinische Daten weisen eine deutliche Reduktion von miR-149 in verschiedenen Krebstypen auf, wobei in Brustkrebs die miR-149-Level vorwiegend im basalen Subtyp reduziert sind. Durch verschiedenste biologische und biochemische Experimente konnte gezeigt werden, dass miR-149 in Zelllinien des basalen Subtyps, wie MDA-MB-231, die Ausbildung und Akti-vität fokaler Adhäsionen hemmt, Rac-Aktivierung inhibiert, und Zellmigration und -invasion deutlich reduziert, in vitro und in vivo. Als potentielle Zielgene konnten Rap1a, Rap1b und Vav2 identifiziert werden. Zudem konnte der beobachtete Phänotyp auch in weiteren Zellli-nien reproduziert werden, was nicht zuletzt auf eine konservierte und zelltypunabhängige Funktion von miR-149 als Tumorsuppressor hindeutet. Zusammengefasst erweitert diese Arbeit die bisherigen Kenntnisse über die miRNA-vermittelte Regulation von brustkrebsrelevanten Signalwegen und liefert darüber hinaus neue Details über deren Zielgene.