Etablierung und Charakterisierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase für die Bioelektrokatalyse in einem dreidimensionalen CNT-Solgel Elektrodensystem

Abstract

Die Motivation dieser durch das BMBF finanzierten ElektroZym Projekts ist die Überwindung der Limitation einer geringen spezifischen Produktleistung der bisher etablierten elektrochemisch getriebenen Cytochrom P450 Monooxygenase (CYP) Applikationen. Diese Applikationen wurden als Alternative zur meist unselektiven chemischen Metall-katalysierten Hydroxylierung entwickelt und stellen unterschiedliche hydroxlierte Produkte zur Verfügung. Dabei sind vor allem hydroxylierte Fettsäuren (OHFA) von Bedeutung, welche als Bausteine (building blocks) zur Synthese von z.B. Geruchs und Geschmackstoffen verwendet werden. Momentan sind diese OHFAs aufgrund der hohen Herstellungskosten nicht kommerziell verfügbar. Das Ziel des Projekts ist die Immobilisierung eines CYP Enzyms in einer dreidimensionalen, auf einer Solgel Matrix basierenden Elektrode. Die kovalente Immobilisierung von CYP Enzymen auf einer planaren Elektrodenoberfläche führt im Idealfall zu einer einfachen Oberflächenbedeckung (Monolayer) der Elektrode mit reduzierbarem Enzym. Die CYP Elektroden sind aufgrund der geringen Oberfläche in ihrer spezifischen Produktleistung stark limitiert. Daher wurde ein optimiertes CYP Enzym für den Einsatz auf Kohlenstoffnanoröhren (CNT) basierten Elektroden etabliert. Als Enzym diente das von einer zusätzlichen Reduktase unabhängige (autarke) CYP 102A1 aus Bacillus megaterium (P450 BM3). Für eine in situ Aktivitätsbestimmung wurde das Enzym auf den Umsatz von Anilin zum elektroaktiven Aminophenol optimiert. Vier Enzymmutanten wurden zusätzlichen mit einer C-terminal lokalisierten und CNT-affinen Petidsequenz (CNT-tag) modifiziert. Diese werden im Folgenden als Modell Proteinvarianten bezeichnet. Diese Sequenz erlaubt die eigenständige und orientierte Anlagerung des Enzyms an der CNT Oberfläche und erleichtert die elektrochemische Hämeisenreduktion des Enzyms entscheidend. Die Hämeisenreduktion dieses P450 BM3 Konstruktes erlaubt die elektrochemisch getriebene enzymatische Hydroxylierung von Anilin. Diese elektrochemisch enzymatische Hydroxlierung erreichte 78 % der Aktivität, der Nicotinamid-abhängigen Susbtratumsetzung. Das CNT-tag modifizierte Enzym wurde ebenfalls für die erfolgreiche „proof-of-concept“ Etablierung einer dreidimensionalen CNT-Solgel Matrix Elektrode verwendet und die spezifische Produktleistung erreichte das dreifache Niveau einer verfgleichbaren planaren Elektrode.