Mikrobielle Biodegradation von Poly(cis-1,4-isopren) : Charakterisierung bakterieller Rubber Oxygenasen

Abstract

Die vorliegende Arbeit untersucht den mikrobiellen Kautschukabbau. Die Rubber Oxygenase A (RoxA) wird von Gram negativen Bakterien sekretiert, wohingegen Gram positive Bakterien das Latex Clearing Protein (LCP) nutzen. Durch Vorarbeiten der AG Jendrossek war es möglich, lcpK30 aus Streptomyces sp. K30 rekombinant in E. coli zu exprimieren und das Genprodukt mittels Strep tag per Affinitätschromatografie aufzureinigen. In Zusammenarbeit mit IBA Lifesciences wurden verschiedene Strep Tactin Säulen eingesetzt und verglichen, die gewonnenen Erkenntnisse ermöglichten eine effizientere Aufreinigung von Lcp. Um spezifische Enzymaktivitäten zu vergleichen, wurde ein Aktivitätstest beschrieben, bei dem der Sauerstoffverbrauch während der Enzymreaktion bestimmt wird. Die generierten Oligo isoprenoid Spaltprodukte wurden per HPLC analysiert. Beide Methoden wurden in einem Methodenprotokoll beschrieben. In Zusammenarbeit mit Sirimaporn Watcharakul (Prince of Songkla University, Thailand) wurde ein neues kautschukabbauendes Bakterium aus dem Abwasser einer Kautschukfabrik in Thailand isoliert und als Rhodococcus rhodochrous RPK1 beschrieben. Das für die Latexspaltung verantwortliche Gen wurde als homologes LCP identifiziert und lcpRr konnte erfolgreich rekombinant in E. coli exprimiert werden. Die Aufreinigung des Genproduktes erfolgte per Affinitätschromatografie mittels Strep tag und ermöglichte die biochemische Charakterisierung von LcpRr. Durch eine bioinformatische Analyse wurden in einem Multisequenzalignment hochkonservierte Aminosäurereste in Lcps identifiziert. Drei dieser Reste sind in einer Domäne unbekannter Funktion (DUF2236) lokalisiert. Mittels Quikchange PCR wurden in lcpK30 die entsprechenden Codons jeweils einzeln gegen Alanin Codons ausgetauscht und die generierten Muteine aufgereinigt, um die mögliche Funktion der jeweiligen Reste in Lcp K30 zu untersuchen. R164A und T168A enthielten jeweils eine Hämgruppe, jedoch zeigten sie eine signifikant reduzierte Aktivität bei der oxidativen Spaltung von Polyisopren. Es konnte gezeigt werden, dass H198 einen axialen Liganden des Häm Eisen Ions darstellt. Die Reste R195 und R202 sind für die Struktur von LcpK30 essentiell, worauf anhand der Instabilität der entsprechenden Alanin Muteine geschlossen wurde. Diese Ergebnisse wurden nach der erfolgreichen Aufklärung der Struktur von LcpK30 durch Röntgenkristallografie bestätigt, welche in Kooperation mit Lorena Ilcu (AG Einsle, Albert Ludwigs Universität Freiburg) durchgeführt wurde. Das Enzym konnte als 3/3 Globin identifiziert werden. Der Globin Kern enthält eine b typ Hämgruppe und zeigt eine Ähnlichkeit zur Struktur von Myoglobin, weist jedoch eine zusätzliche L Helix auf und wird von weiteren C und N terminalen Helices umschlossen. Durch weitere Experimente gelang es, zwei mögliche Reaktionsmechanismen der oxidativen Polyisopren Spaltungsreaktion zu postulieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass das Häm Eisen Ion von LcpK30 sowohl pentakoordiniert, als auch hexakoordiniert vorliegen kann, was durch eine Verdrängung des zweiten axialen Häm Liganden K167 durch Imidazol in einer weiteren aufgeklärten Kristallstruktur gezeigt wurde. Die enzymatische Synthese von Oligo isoprenoiden im 100 mg Maßstab wurde durch eine Vergrößerung des Reaktionsansatzes auf 1 Liter Latexmilch erreicht und ermöglichte es, per FPLC eine Auftrennung der Mischung zu erzielen und reine Oligo isoprenoide bereitzustellen. Im mittlerweile komplett sequenzierten Genom von Xanthomonas sp.35Y wurde ein zu roxA homologes Gen identifiziert. Es gelang, dieses rekombinant zu exprimieren und das entsprechende Protein chromatografisch aufzureinigen. Dessen biochemische Charakterisierung zeigte Ähnlichkeiten zu RoxA wie eine vergleichbare Molekülmasse, sowie zwei Häm Bindemotive. Bei der Inkubation mit Latexmilch wurde der Verbrauch von Sauerstoff beobachtet, jedoch wurde per HPLC nicht das C15 Oligo isoprenoid 12 oxo 4,8 dimethyl trideca 4,8 dien 1 al (ODTD) als Hauptprodukt identifiziert, sondern die bereits bei Lcp beobachtete Mischung höherer Oligo isoprenoide. Daher wurde das Enzym RoxB genannt. Des Weiteren wurde ein synergistischer Effekt der Enzymaktivität von RoxB auf RoxA beschrieben. Dieser Effekt wurde auch für Rhizobacter gummiphilus bestätigt, indem beide Rubber Oxygenasen dieses Stammes aufgereinigt und charakterisiert wurden. Wachstumsversuche mit verschiedenen Bakterienstämmen wurden durchgeführt und es gelang erstmals, eine Wachstumskurve von Xanthomonas sp.35Y beim Wachstum in Flüssigkultur mit Latex als alleiniger Kohlenstoffquelle zu bestimmen. Die so gewonnenen Zellen wurden zur Proteomanalyse eingesetzt und zahlreiche Proteine des Metabolismus konnten nachgewiesen werden.

This thesis investigates the microbial biodegradation of natural rubber. Numerous rubber oxygenases were isolated from Gram negative bacteria (Rubber Oxygenase A, RoxA) or Gram positive bacteria (Latex Clearing Protein, Lcp). Previous studies in the AG Jendrossek allowed for the recombinant expression of lcpK30 from the potent rubber degrader Streptomyces sp. K30 in E. coli. In an application note in cooperation with IBA Lifesciences different resins for the purification of Strep tagged LcpK30 were compared enabling a more efficient purification. To determine enzyme activities, assays for the detection of rubber oxygenase activities by monitoring of the oxygen consumption or separation of generated Oligo isoprenoids by HPLC were described. Sirimaporn Watcharakul (Prince of Songkla University, Thailand) supplied effluent from a rubber processing facility in Thailand enabling the isolation of the novel rubber degrading species Rhodococcus rhodochrous RPK1. The gene responsible for rubber degradation was identified as a homologue Lcp and the coding gene, lcpRr, was successfully transferred into the described E. coli expression system enabling the purification and characterization of Strep tagged LcpRr. Numerous genomic sequences coding for Lcps are available in databases and multiple sequence alignments revealed the presence of highly conserved residues within a domain of unknown function (DUF2236) in Lcps. Quikchange PCR based mutagenesis was used to replace conserved residues by alanine to investigate their potential functions. LcpK30 muteins R164A and T168A contained the heme group but were inactive whereas generated results indicated the role of H198 as a potential axial heme ligand. Residues R195 and R202 seemed to be necessary for the stability of LcpK30 since alanine muteins R195A and R202A were unstable. These data were confirmed by the successful crystallization of LcpK30 and structural analysis by X ray diffraction performed by Lorena Ilcu (AG Einsle, Albert Ludwigs University Freiburg). The three dimensional structure was solved and the fold was identified as a 3/3 globin. It features one b type heme group comparable to myoglobin but with additional C and N terminal helices as well as one additional conserved L helix. Further experiments allowed the postulation of two possible reaction mechanisms for the oxidative cleavage of polyisoprene by Lcp. In addition, a shift of Lcp from an open to a closed conformation was observed in a second crystal structure. In this structure, imidazole from the crystallization buffer displaced the unusual axial heme ligand K167. The complete draft genome of Xanthomonas sp.35Y was determined recently and a gene homologue to roxA was identified. The corresponding gene was overexpressed and a protein was purified. The biochemical characterization showed similarities to RoxA, especially a comparable molecular mass and two binding sites likely enabling the covalent attachment of heme groups. Analysis of the polyisoprene cleavage revealed a mixture of oligo isoprenoids as observed for Lcp, therefore the name RoxB was chosen. A cooperative effect of RoxB upon RoxA activity was observed indicating the importance of both rubber oxygenases to allow for the efficient biodegradation of latex by Xanthomonas sp. 35Y. The same effect was observed for both rubber oxygenases from Gram negative Rhizobacter gummiphilus NS21, which were purified and characterized. To enable a possible use of oligo isoprenoids as precursors for fine chemicals or high energy dense biofuels, polyisoprene containing latex was incubated with rubber oxygenases and 100 mg of oligo isoprenoids could be extracted from one liter. By means of FPLC or HPLC, chromatographic purification of higher oligo isoprenoids was achieved. Growth experiments of microbial rubber degraders with different minimal media were performed and the use of latex agar in shaking flasks enabled the determination of a growth curve of Xanthomonas sp.35Y in liquid culture. For comparison, cultures grown with sodium octanoate served as a control. Cells were harvested and used for proteome analysis allowing the identification of proteins involved in rubber metabolism of Xanthomonas sp.35Y.