Deleted in Liver Cancer 3 (DLC3) in the regulation of junctional Rho signaling and cell polarity

Abstract

Apicobasal cell polarity is essential for normal epithelial function and tissue integrity and established by several polarity proteins. Cell polarization, including the formation and maintenance of cell-cell contacts, also requires spatially restricted cytoskeleton remodeling. Small Rho GTPases function as key regulators of cytoskeleton dynamics and are thus involved in fundamental cellular processes like cell polarity and cell-cell adhesion. However, the spatial control of cellular Rho signaling by its regulators, specific guanine nucleotide exchange factors (GEF) and GTPase-activating proteins (GAP), is still poorly understood. The deleted in liver cancer (DLC) proteins represent a family of RhoGAPs that is frequently downregulated in different types of cancer and comprises three structurally related family members, DLC1/2/3. There is growing evidence that the different DLC proteins also possess non-redundant functions and are regulated by isoform-specific mechanisms based on their distinct subcellular localizations. The still poorly characterized DLC3 isoform was reported to localize to adherens junctions and Rab8-positive membrane tubules, besides its association with focal adhesions which is common to all DLC isoforms. Considering that the DLC3 interactome is still largely unknown, it is unclear how DLC3 is recruited to specific subcellular sites to execute its functions. In this study, DLC3 protein binding partners were identified using a proteomic approach. By this means, the basolateral polarity protein Scribble was discovered as the first isoform-specific scaffold for DLC3 at adherens junctions. The interaction was mapped to the PDZ domains of Scribble and a unique PDZ ligand (PDZL) motif in DLC3 and both Scribble depletion and PDZL deletion abrogated DLC3 junctional localization. Using a RhoA biosensor and a targeted GAP domain, convincing evidence was provided for DLC3 as local regulator of RhoA-ROCK signaling at and Scribble localization to cell-cell adhesions controlling E-cadherin function and junctional integrity. In addition to their role at adherens junctions, DLC3 and Scribble were shown to restrict RhoA-ROCK signaling at the leading edge of cells that polarize during directed cell migration. In a three-dimensional model system of cyst development, DLC3 and Scribble depletion furthermore impaired epithelial morphogenesis and lumen formation, emphasizing the relevance of both proteins for the establishment of cell polarity. Taken together, these findings uncover a new control mechanism for spatial Rho regulation that involves Scribble-mediated positioning of DLC3’s GAP activity at cell junctions in polarized epithelial cells.

Apikobasale Zellpolarität ist unerlässlich für die normale Funktion von Epithelien und für Gewebsintegrität und wird durch etliche Polaritätsproteine aufgebaut. Zellpolarisierung, einschließlich der Ausbildung und Aufrechterhaltung von Zellkontakten, erfordert auch eine räumlich begrenzte Remodellierung des Zytoskeletts. Kleine Rho-GTPasen fungieren als Schlüsselregulatoren des Zytoskelettumbaus und sind daher involviert in grundlegende, zelluläre Prozesse wie Zellpolarität und Zell-Zell-Adhäsion. Allerdings ist die räumliche Kontrolle der Rho-Signalgebung in der Zelle durch ihre Regulatoren, spezifische GEF- (guanine nucleotide exchange factors) und GAP-Proteine (GTPase-activating proteins), noch unzureichend verstanden. Die DLC-Proteine (deleted in liver cancer) stellen eine RhoGAP-Proteinfamilie dar, welche in verschiedenen Krebsarten häufig dereguliert ist und drei strukturell verwandte Familienmitglieder umfasst, DLC1/2/3. Es gibt vermehrt wissenschaftliche Belege dafür, dass die unterschiedlichen DLC-Proteine auch nicht-redundante Funktionen ausüben und durch isoform-spezifische Mechanismen kontrolliert werden aufgrund ihrer unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen. Für die noch unzulänglich charakterisierte DLC3-Isoform wurde eine Lokalisation an adherens junctions und Rab8-positiven, tubulären Strukturen festgestellt, neben ihrer Assoziation mit fokalen Adhäsionskontakten, welche alle drei DLC-Proteine miteinander gemein haben. Da das DLC3-Interaktom noch weitestgehend unbekannt ist, ist es unklar, wie DLC3 an spezifische subzelluläre Orte rekrutiert wird, um dort seine Funktionen auszuführen. In dieser Studie wurden mit Hilfe eines proteomischen Ansatzes DLC3-Proteinbindungspartner identifiziert. Auf diese Weise wurde das basolaterale Polaritätsprotein Scribble als erstes isoform-spezifisches Gerüstprotein für DLC3 an adherens junctions entdeckt. Die Interaktion beruht auf den Scribble-PDZ-Domänen und einem einzigartigen PDZ-Bindemotiv in DLC3 und sowohl Scribble-Verlust als auch die Deletion des PDZ-Bindemotivs hoben die Lokalisation von DLC3 am Zellkontakt auf. Unter Verwendung eines RhoA-Biosensors und einer zielgerichteten GAP-Domäne wurden überzeugende Nachweise für DLC3 als lokalen Regulator der RhoA-ROCK-Signalgebung und Scribble-Lokalisation am Zellkontakt geliefert, welche die Funktion von E-Cadherin und Intaktheit der Zelladhäsionen kontrollieren. Zusätzlich zu ihrer Rolle an adherens junctions wurde gezeigt, dass DLC3 und Scribble RhoA-ROCK-Signaling am Leitsaum von Zellen einschränken, die während der gerichteten Zellmigration polarisieren. DLC3- und Scribble-Knockdown in einem 3D-Modell der Zystenbildung verhinderten außerdem epitheliale Morphogenese und Lumenbildung, was die Bedeutung beider Proteine bei der Ausbildung von Zellpolarität hervorhebt. Zusammengenommen decken diese Ergebnisse einen neuen Kontrollmechanismus für lokale Rho-Regulation auf, welcher die genaue Positionierung der DLC3-GAP-Aktivität an Zellkontakten in polarisierten Epithelzellen durch Scribble beinhaltet.