Identification and production of cardio-inductive extracellular matrix proteins for applications in regenerative medicine

Abstract

Cardiovascular disease (CVD) remains one of the leading causes of death in the world, despite significant advances that have been made in cardiology and cardiac surgery in order to change this fact. The most common cause of acute damage to the heart is a myocardial infarction (MI) event. Oxygen depletion during MI leads to a rapid loss of cardiomyocytes at the site of injury, which drastically and permanently impairs the heart’s contractile force and the patients’ quality of life. Unlike in the highly organized extracellular matrix (ECM) microenvironment in healthy myocardium, this remodeling process is characterized by an imbalanced turnover of ECM proteins and interstitial fibrosis. To address this major health problem, the regeneration of functional cardiac tissue and restoration of heart function is the driving goal for researchers worldwide. In early human development, wounds heal rapidly and without the formation of a scar. Fetal wound healing has the potential to not only close the wound, but to regenerate functional tissue and therefore be a blueprint for ideal tissue repair. These findings provided the basis for the hypothesis of this work, which describes how a specific cardiovascular ECM at the onset of human cardiogenesis could contain key ECM proteins to promote cardioinduction and increase the heart’s potential for functional tissue regeneration. In order to identify specific ECM proteins that provide cardiovascular microenvironmental cues during human embryogenesis, we used embryoid bodies (EBs) generated from human embryonic stem cell (hESC) line H9 as a model for early human development. The results of this work show that an efficient cardiovascular differentiation protocol could be designed that generates a high number of spontaneously beating EBs. The expression patterns of the non-fibrillar ECM proteins decorin and nidogen-1 in the beating EBs were identified by real-time polymerase chain reaction (qPCR) analysis. Decorin and nidogen-1 expression is significantly increased during cardiovascular differentiation of hESCs in EBs, suggesting an important role of these proteins in early cardiac development. This result is supported by semi-quantitative analysis of immunofluorescence (IF) images. In order to test the potential of these proteins to support cardiovascular differentiation in vitro or to serve as potential therapeutic candidates, stable clones for the recombinant expression of active human decorin and nidogen-1 were generated. The production clones that provided the highest yields were adapted to suspension culture and serum depletion, followed by production up-scaling and protein purification using fast protein liquid chromatography (FPLC)-controlled methods. The identity and purity of the decorin and nidogen-1 concentrates was verified with specific antibodies. Glycosylation status and activity of these purified ECM proteins could be confirmed utilizing deglycosylation enzymes and Co-Immunoprecipitation (Co-IP) with known interaction partners. The hypothesis of this work was tested in vitro, using the purified decorin and nidogen-1 as coatings on cell culture dishes. A cardio-inductive effect of nidogen-1 on hESC-derived EBs could be shown for the first time, as identified by a significant increase of cardiovascular differentiation efficiency on the coating containing nidogen-1. The effect of decorin and nidogen-1 injections were tested in vivo in a mouse MI and reperfusion (MI/R) model. Echocardiography revealed a significant increase of the ejection fraction (EF), an important physiological parameter for heart function, in the mice that received nidogen-1 injections compared to the control mice four weeks post MI/R. This effect resulted in a remarkable difference of 14.5% EF to the control mice. Qualitative histological analyses revealed that the cardiac morphology was better preserved and showed less pathological remodeling due to the nidogen-1 treatment compared to controls. The results presented in this thesis include the identification of the potentially cardio-inductive hESC-derived cardiovascular ECM proteins decorin and nidogen-1, their recombinant production in CHO cells and the establishment of an in vitro hESC-based test system, with which we showed for the first time a cardio-inductive effect of nidogen-1. In addition, utilization of a small animal MI/R model revealed a significantly improved heart function and qualitative histological analyses showed a better preservation of cardiac morphology and lower degree of pathological remodeling after peri-infarct injections of nidogen-1 compared to controls. These results provide a direct reference towards the development of an early-stage nidogen-1-based therapy for the prevention of heart failure.

Kardiovaskuläre Erkrankungen bleiben trotz großer Fortschritte in der Kardiologie und Herzchirurgie eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Meist entstehen akute Schädigungen des Herzens durch myokardiale Infarkte (MI). Sauerstoffmangel während eines akuten Herzinfarktes führt innerhalb kurzer Zeit zum Absterben von Herzmuskelzellen, den Kardiomyozyten, in der Infarktregion, was eine drastische und anhaltende Beeinträchtigung der Kontraktionsfähigkeit des Herzen verursacht und somit die Lebensqualität des Patienten stark einschränkt. Durch das kaum bis nicht vorhandene Regenerationspotential des Herzens ist kein angemessener Wiederaufbau von funktionalem Gewebe möglich. Anstatt dessen entsteht eine Narbe aufgrund anhaltender Ausgleichsmechanismen, die sich nicht nur auf den Infarktbereich beschränken, sondern auch in entfernten Bereichen des Herzens ihre Effekte ausüben [1, 2]. Während sich gesundes Myokardium durch eine hoch organisierte extrazelluläre Matrix (ECM) auszeichnet, verursacht der MI-induzierte, pathologische Remodellierungsprozess den gestörten Umsatz von ECM-Proteinen und Fibrose. Er hat einen erheblichen Einfluss auf die ECM-Zusammensetzung und Organisation, die zunächst zu kardialer Versteifung und beeinträchtigter elektrischer Signalweiterleitung führen, und über Jahre hinweg krankhafte Verformungen und Herzversagen verursachen können [3, 4]. Das antreibende Ziel von Wissenschaftlern weltweit um dieses große Gesundheitsproblem zu bekämpfen ist die Regeneration gesunden Herzgewebes und der Herzfunktion. In der frühen menschlichen Entwicklung heilen Wunden schnell und ohne die Entstehung von Narben. Fetale Wundheilung hat das Potential Wunden nicht nur zu schließen, sondern funktionales Gewebe wiederherzustellen und dient daher als Vorbild für ideale Gewebereparatur. Somit unterscheidet sich der fetale Wundheilungsprozess grundlegend vom entsprechenden Prozess im adulten Organismus, der häufig mit pathologischer Fibrose verbunden ist. Ein möglicher Grund für diesen Unterschied könnte die einzigartige fetale ECM Organisation und Zusammensetzung sein. Vor diesem Hintergrund wurde die Hypothese dieser Arbeit formuliert, die besagt, dass die spezifische kardiovaskuläre ECM zu Beginn der humanen Kardiogenese Proteine enthält, welche eine kardioinduktive Schlüsselfunktion besitzen und das Potential des Herzens für funktionale Geweberegeneration erhöhen könnten. Um diese ECM Proteine zu identifizieren, haben wir aus der humanen embryonalen Stammzelllinie H9 (hESC H9) embryoid bodies (EBs) hergestellt, die als Modell der frühen menschlichen Entwicklung dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein effizientes kardiovaskuläres Differenzierungs-protokoll entwickelt werden konnte, mit welchem innerhalb von 10 Tagen spontan-schlagende EBs erzeugt werden konnten (85% ± 17.6%), die einen hohen Prozentsatz an Kardiomyozyten enthalten (49.4% ± 11.4% MF20-positive Zellen). Die schlagenden EBs repräsentieren eine frühe Stufe der humanen kardiovaskulären Differenzierung und sekretieren ihre eigene ECM. Mittels qPCR Analyse wurde die signifikant erhöhte Expression der nicht-fibrillären ECM Proteine Decorin und Nidogen-1 während der kardiovaskulären Differenzierung der hESCs in EBs gezeigt. Dies deutet auf eine wichtige Rolle dieser Proteine in der frühen Herzentwicklung hin. Die semi-quantitative Analyse von Immunfluoreszenzbildern unterstützt dieses Ergebnis, da sie eine signifikant höhere Menge von Decorin und Nidogen-1 in den schlagenden EBs an Tag 10 der kardiovaskulären Differenzierung im Vergleich zu Fibronektin, Periostin, den Lamininen, Kollagen Typ IV und Typ I aufdeckt. Um das Potential dieser Proteine für die Erhöhung der kardiovaskulären Differenzierung in vitro oder als Therapie nach einem Herzinfarkt testen zu können, mussten zunächst stabile Zellklone für die rekombinante Produktion von humanem Decorin und Nidogen-1 hergestellt werden. Plasmide für I) ein permanentes und II) ein induzierbares Produktionssystem wurden konzipiert und in eine Dihydrofolatreduktase-defiziente Zelllinie aus dem Ovarium des Chinesischen Hamsters (CHO Zellen) transfiziert. Die Selektion mit Methotrexat (MTX) ermöglichte eine signifikante Steigerung der Decorin und Nidogen-1 Produktion, mit Konzentrationen im Kulturmedium bis zu 42.8 µg/ml Decorin und 4.2 µg/ml Nidogen-1. Die Produktionsklone, die den höchsten Ertrag brachten, konnten an Suspensionskultur und Serumreduktion angepasst werden. Anschließend folgte die Produktion in größerem Maßstab und die FPLC-gesteuerte Aufreinigung, bei der 73% - 78% der Proteinausgangsmenge erhalten wurde. Die Identität und Reinheit der Decorin und Nidogen-1 Konzentrate konnte mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Der Glykosylierungsstatus und die Aktivität dieser aufgereinigten ECM Proteine wurden mit Hilfe von Deglykosylierungsenzymen und Co-Immunpräzipitationen mit bekannten Interkationspartnern bestätigt. Die Hypothese dieser Arbeit wurde in vitro mit Beschichtungen von Zellkulturplatten mit aufgereinigtem Decorin und Nidogen-1 getestet. Ein signifikanter Anstieg der kardiovaskulären Differenzierungseffizienz durch die Nidogen-1 Beschichtung zeigte den kardioinduktiven Effekt von Nidogen-1 auf EBs aus hESCs. In vitro Tests ergaben, dass die Auswirkung von Decorin und Nidogen-1 auf die humane Immunzell-Proliferation und Aktivierung bei der Konzentration 50 µg/ml unbedenklich war. Daher wählten wir diese Konzentration für den Test von Decorin und Nidogen-1 Injektionen im Anschluss an einen Myokardinfarkt in einem in vivo Maus Modell. Nach dem Infarkt und den Injektionen in den Infarkt-umgrenzenden Bereich folgten an drei verschiedenen Zeitpunkten echokardiographische Untersuchungen der Mäuse. Diese Untersuchungen zeigten bei den Mäusen denen Nidogen-1 oder eine Kombination von Decorin und Nidogen-1 injiziert wurde zum Zeitpunkt zwei Wochen nach dem Myokardinfarkt eine signifikante Erhöhung der Auswurfsfraktion (EF), einem wichtigen Parameter für die Herzfunktion, im Vergleich zu den Kontrollgeweben. Zum letzten untersuchten Zeitpunkt, vier Wochen nach dem Infarkt, blieb der positive Effekt der Nidogen-1 Injektionen auf die Herzfunktion mit einer Erhöhung um 14.5% EF verglichen mit den Kontrollmäusen ähnlich hoch. Vier Wochen nach dem Myokardinfarkt wurden an den entnommenen Herzen der Mäuse H&E und Russel-Movat Pentachrom Färbungen, sowie IF Färbungen des Kardiomyozyten Marker Proteins cTnT durchgeführt. Eine qualitative Auswertung der histologischen Untersuchungen ergab, dass die Morphologie der mit Nidogen-1 behandelten Herzen besser erhalten war und diese weniger krankhafte Remodellierung aufwiesen als die Kontrollherzen. Die in dieser Doktorarbeit dargestellten Ergebnisse umfassen die Identifizierung der potentiell kardioinduktiven ECM Proteine Decorin und Nidogen-1 aus einer von hESCs gebildeten, kardiovaskulären Matrix, sowie deren rekombinante Herstellung in CHO Zellen. Zudem konnte ein in vitro Testsystem aufgebaut werden, welches zum ersten Mal die kardioinduktive Wirkung von Nidogen-1 zeigt. In einem Kleintiermodell, bei dem nach einem induzierten MI Nidogen-1 Injektionen in den Infarkt umgebenden Bereich verabreicht wurden, ergab sich eine signifikante Verbesserung der Herzfunktion und qualitative histologische Analysen zeigten einen verbesserten Erhalt der kardialen Morphologie und ein geringeres Ausmaß an krankhafter Remodellierung im Vergleich zu den Kontrollgeweben. Diese Ergebnisse stellen den ersten Schritt auf dem Weg zur Entwicklung einer frühzeitigen, Nidogen-1 basierten Therapie gegen Herzversagen dar.