Enzymatic characterization of protein lysine methyltransferases

Abstract

Histone lysine methylation is an epigenetic mechanism that is involved in the regulation of many biological processes. Over the last decade, the global interest in protein lysine methylation events increased drastically, because several protein lysine methyltransferases (PKMTs) and lysine methylation sites were identified in the genomes and proteomes of many organisms also including non-histone proteins functioning as substrates for PKMTs. The fast development of this field has moved the understanding of the biological outcome of lysine methylation into the center of research. Most urgently, it is necessary to improve our knowledge about lysine methylation by connecting specific target sites with the responsible PKMT and identifying the full substrate spectrum of PKMTs. In this thesis substrate specificity analysis was performed to tackle this challenge. It was shown that methylation of substrate specificity arrays is a good approach to analyze the substrate preference of PKMTs and identify subtle differences between related enzymes with same overall specificity. Furthermore, substrate specificity analysis was shown to be useful for the identification of novel substrates, which was successfully demonstrated for SUV4-20H1, SUV4-20H2, MLL1 and MLL3 in the present study. In vitro methylation experiments indicated that SUV4-20H1 and SUV4-20H2 introduce dimethylation on H4K20 using monomethylated H4K20 as substrate. SUV4-20H1 and SUV4-20H2 have an overlapping sequence motif, but SUV4-20H2 is less specific. This result was supported by the identification of one novel non-histone substrate for SUV4-20H1 and three non-histone targets for SUV4-20H2. MLL1 and MLL3 are H3K4 methyltransferases, but they belong to different MLL subfamilies. MLL1 catalyzes H3K4 trimethylation at promotors of developmental genes, whereas MLL3 introduces H3K4 monomethylation at enhancers. MLL1 and MLL3 are parts of related multi protein complexes also containing WDR5, RBBP5 and ASH2L. Substrate specificity analysis of MLL1 showed that it accepts several other residues at many positions of the target sequence, in addition to the residues in the original sequences of H3. At the protein level two novel substrates (TICRR and ZNF862) were methylated by MLL1. Comparison of the relative activity showed that the H3 protein was the best target in the absence of complex partners, but ZNF862 was preferred in presence of WRA. Finally, my data indicate that the substrate specificity of MLL3-WRA differed slightly from MLL1, suggesting that they may have different non-histone substrates. In several publications, assignments between PKMTs and methylated histone or non-histone target sites have been reported, but in some cases the data are questionable. This could lead to wrong interpretation of biological processes and misleading of follow-up studies. It has been shown for two examples in this study, that substrate specificity analysis can be used to identify problematic assignments between PKMT and methylation events, which need to be studied experimentally to confirm the published findings. Vougiouklakis et al. (2015) reported that SUV4-20H1 methylates ERK1 at K302 and K361, but these target sites do not fit to the specificity profile of SUV4-20H1. Indeed, I could not detect methylation of ERK1 by SUV4-20H1 or SUV4-20H2 at peptide and protein level although positive controls showed the expected methylation. Dhami et al. (2013) reported that Numb protein is methylated by SET8 at K158 and K163, which was not in agreement with the specificity data of SET8. In this thesis, Numb peptide and protein methylation was studied using recombinant SET8 purified from E.coli or HEK293 cells. In both cases, no methylation of Numb could be observed. These data suggest that these assignments of methylation substrates and PKMTs are likely not correct. Whole genome and whole transcriptome sequencing projects have frequently found somatic mutations in epigenetic enzymes in cancers. Somatic cancer mutations can have loss-of-function or gain-of-function effects on the enzymatic properties of PKMTs. Especially gain-of-function effects are a challenge in understanding their role in carcinogenesis. In this study, the effects of somatic cancer mutations found in the SET domain of MLL1 and MLL3 were analyzed. Four somatic cancer mutations of MLL1 and three of MLL3 were selected for analysis on the basis of their location close to binding sites of AdoMet, peptide or the interaction partners. The investigation of somatic cancer mutations in MLL1 and MLL3 indicated that each specific mutation has its unique effect on the enzymatic activity, product or substrate specificity and principle regulatory mechanism indicating that each mutant needs specific in depth experimental investigation in order to understand its carcinogenic effect. Moreover, inhibitor studies demonstrated that each mutant needs to be experimentally studied to allow for the development of mutation specific therapeutic strategies.

Die Lysin-Methylierung von Histonen ist ein epigenetischer Mechanismus, der an der Regulation vieler biologischer Prozesse beteiligt ist. In den letzten Jahren hat das Interesse an der Lysin-Methylierung von Proteinen deutlich zugenommen, da eine Vielzahl von Protein-Lysin-Methyltransferasen (PKMTs) und Lysin-Methylierungsstellen in den Genomen und Proteomen von verschiedenen Organismen identifiziert wurden. Zusätzlich wurden auch Nicht-Histon-Proteine als mögliche Substrate für PKMTs entdeckt. Diese rasante Entwicklung hat die Lysin-Methylierung und deren Verständnis in den Mittelpunkt der Forschung gerückt. Um unser Wissen über die Lysin-Methylierung weiter zu verbessern, ist es wichtig die spezifischen Lysin Methylierungsstellen mit den verantwortlichen PKMTs in Verbindung zu bringen und das gesamte Substrat-Spektrum von PKMTs zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde eine Substratspezifitäts-Analyse durchgeführt, um dieser Herausforderung gerecht zu werden. Es wurde gezeigt, dass die Methylierung von Peptidarrays ein guter Ansatz ist, um die Substratpräferenz von PKMTs zu analysieren und um geringfügige Unterschiede zwischen verwandten Enzymen mit der gleichen Gesamtspezifität zu identifizieren. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Substratspezifitäts-Analyse für die Identifizierung neuer Substrate von Nutzen ist, was in der vorliegenden Arbeit für SUV4-20H1, SUV4-20H2, MLL1 und MLL3 erfolgreich nachgewiesen wurde. In vitro Methylierungsexperimente haben gezeigt, dass SUV4-20H1 und SUV4-20H2 unter der Verwendung von monomethyliertem H4K20 als Substrat eine Dimethylierung von H4K20 katalysieren. SUV4-20H1 und SUV4-20H2 haben ein überlappendes Sequenzmotiv, wobei SUV4-20H2 eine geringere Spezifität aufweist. Dieses Ergebnis wurde durch die Identifizierung eines neuartigen Nicht-Histon-Substrats von SUV4-20H1 und von drei Nicht-Histon-Substraten für SUV4-20H2 bestätigt. MLL1 und MLL3 sind H3K4-Methyltransferasen, aber sie gehören zu verschiedenen MLL-Unterfamilien. MLL1 katalysiert die H3K4-Trimethylierung an Promotoren von Entwicklungsgenen, während MLL3 die Monomethylierung von H3K4 an Enhancern katalysiert. MLL1 und MLL3 sind beide Teil eines Multiproteinkomplexes, der unter anderem aus WDR5, RBBP5 und ASH2L besteht. Die Substratspezifitäts-Analyse von MLL1 hat gezeigt, dass MLL1 neben den Aminosäuren der ursprünglichen Sequenzen von H3 auch mehrere andere Aminosäuren an zahlreichen Stellen der Zielsequenz toleriert. Auf Proteinebene wurden zwei neue Substrate (TICRR und ZNF862) von MLL1 methyliert. Der Vergleich der relativen Aktivität hat gezeigt, dass das H3 Protein das bevorzugte Substrat in Abwesenheit der Komplexpartner war, wobei ZNF862 in Gegenwart von WRA bevorzugt wurde. Letztendlich haben die Ergebnisse gezeigt, dass sich die Substratspezifität von MLL3-WRA geringfügig von MLL1 unterscheidet, was darauf hindeutet, dass MLL3-WRA und MLL1 unterschiedliche Nicht-Histon-Substrate erkennen können. In mehreren Publikationen wurde über die Zuordung von PKMTs und methylierte Histon- und Nicht-Histon-Substratproteine berichtet, deren Ergebnisse jedoch fragwürdig sind. Dies könnte zu einer falschen Interpretation biologischer Prozesse und zur Irreführung von Folgeuntersuchungen führen. In dieser Arbeit wurde anhand von zwei Beispielen gezeigt, dass die Substratspezifitäts-Analyse verwendet werden kann, um problematische Zuordnungen zwischen PKMT und Methylierungsereignis zu identifizieren, welche experimentell untersucht werden müssen, um die veröffentlichten Ergebnisse zu überprüfen. Vougiouklakis und Mitarbeiter berichteten 2015, dass K302 und K361 von ERK1 durch SUV4-20H1 methyliert würden. Allerdings passen diese Methylierungsstellen nicht zum Spezifitätsprofil von SUV4-20H1. Tatsächlich konnte keine Methylierung von ERK1 durch SUV4-20H1 oder SUV4-20H2 auf Peptid- und Protein-Ebene nachgewiesen werden, obwohl Positivkontrollen die erwartete Methylierung aufweisen. Die Arbeitsgruppe um Dhami berichtete 2013, dass das Numb Protein durch SET8 an K158 und K163 methyliert wird, was wiederum nicht mit den Spezifitätsergebnissen von SET8 übereinstimmt. In dieser Arbeit wurde die Methylierung von Numb auf Peptid- und Proteinebene unter der Verwendung von rekombinantem SET8 (aufgereinigt aus E.coli oder HEK293-Zellen) untersucht. In beiden Fällen konnte keine Methylierung von Numb beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Zuordnungen zwischen Methylierungssubstraten und PKMTs wahrscheinlich nicht richtig sind. In Genom- und Transkriptom Sequenzierungsprojekten wurden häufig auftretende somatische Mutationen in epigenetischen Enzymen gefunden, die zur Krebsentwicklung führen. Somatische Krebsmutationen können „loss-of-function“ oder „gain-of-function“ Effekte auf die enzymatischen Eigenschaften von PKMTs haben. Insbesondere die „gain-of-function“ Effekte stellen für das Verständnis ihrer Rolle bei der Krebsentstehung eine Herausforderung dar. In dieser Arbeit wurden die Effekte von somatischen Krebsmutationen analysiert, die in der SET-Domäne von MLL1 und MLL3 gefunden wurden. Vier somatische Krebsmutationen von MLL1 und drei von MLL3 wurden aufgrund ihrer Position in der Nähe der Bindungsstellen von AdoMet, Peptid oder den Interaktionspartnern ausgewählt. Die Untersuchung der somatischen Krebsmutationen in MLL1 und MLL3 hat gezeigt, dass jede spezifische Mutation einen speziellen Effekt auf die enzymatische Aktivität, die Produkt- oder Substratspezifität und den prinzipiellen regulatorischen Mechanismus hat. Das bedeutet, dass für jede Mutante spezifische und detaillierte experimentelle Untersuchungen erforderlich sind, um ihre karzinogene Wirkung zu verstehen. Darüber hinaus haben Inhibitorstudien gezeigt, dass jede Mutante experimentell untersucht werden muss, um die Entwicklung von mutationsspezifischen therapeutischen Strategien zu ermöglichen.