Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 : systematische Analyse der aktiven Tasche

Abstract

Die gezielte Oxyfunktionalisierung von Olefinen gehört zu den am meist gesuchten Reaktionen in der Chemie. Insbesondere die Dihydroxylierung und die daraus resultierenden chiralen, vicinalen 1,2-Diole spielen hierbei eine wichtige Rolle. So werden 1,2-Diole sowohl als chirale Liganden und Auxiliare und als chirale Synthons für Pharmabausteine sowie Agrochemikalien eingesetzt. Eine schnelle und effiziente Möglichkeit für die stereoselektive, asymmetrische Sharpless Dihydroxylierung (AD) von C=C-Doppelbindungen ergibt sich aus der Metall-katalysierten Oxyfunktionalisierung mittels Osmium oder anderen Übergangsmetallen. Neben der guten Ausbeute und der hohen Selektivität, stellen jedoch vor allem die Toxizität der Katalysatoren, sowie auch die Überoxidation und Spaltung der generierten cis-Diole Herausforderungen in der Anwendung dar. Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) sind eine biologische Alternative zur rein chemischen, asymmetrischen Dihydroxylierung. In der Natur sind diese Multikomponentensysteme, bestehend aus einer hexameren Oxygenase, einem Elektronen-Shuttlemolekül und einer Reduktase, für die Dihydroxylierung von aromatischen Motiven verantwortlich und katalysieren den ersten Schritt im Katabolismus von Aromaten. Mit der Entdeckung dieser effizienten Bio-katalysatoren wurde eine umweltfreundliche Alternative zur chemisch katalysierten Sharpless AD entdeckt. Aufgrund der Verfügbarkeit von Kristallstrukturen wurde die Naphthalen Dioxygenase (NDO) aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 als ein Vertreter der ROs für das semi-rationale Design ausgewählt und Varianten im aktiven Zentrum des Enzyms generiert. Neben der direkten Katalyse am aromatischen Ring, wurde durch Variation der Substituenten auch die allylische Mono- bzw. die cis-Dihydroxylierung von Alkenylresten in aromatischen Molekülen (z. B. α-Methylstyrol, Allylbenzol) und die Katalyse von C=C-Doppelbindungen in nicht-aromatischen, nicht-planaren Molekülen (z. B. R-Limonen) gezeigt. Aufgrund der Vielfältigkeit dieser Enzyme besteht ein gesteigertes Interesse am biotechnologischen Einsatz, um das enorme Potential und die Vielfältigkeit des biokatalytischen Repertoires dieser Katalysatoren ausschöpfen zu können. Des Weiteren erfolgte die nähere Betrachtung der heterologen Herstellung des Biokatalystors in Escherichia coli, wobei sowohl in vitro als auch in vivo Systeme betrachtet wurden. Hierbei stand im Fall der in vitro Untersuchungen das Zusammenspiel der unterschiedlichen Komponenten des Systems, das Reaktionssetup und der Einfluss des Cosolvents im Mittelpunkt. Für das optimierte in vitro System wurden schließlich folgende Parameter definiert: (I) Verhältnis der Komponenten mit 1 μM Oxygenase, 20 μM Ferredoxin und 5 μM Reduktase, (II) das Reaktionssetup mit 2 mM Substrat in Ethanol bei 30 °C für 2 h, und (III) der Anteil des Cosolvents Ethanol mit 5 %(v/v). Ein Alanin-Scan der zwölf first shell Aminosäuren lieferte im in vitro System bereits erste Indizien für relevante Mutagenese-Hotspots mit den Positionen A206, H295, L307, G204 und V260. Im Gegensatz zum in vivo System wurde im in vitro System eine deutlich erniedrigte Aktivität gegenüber den untersuchten substituierten Aromaten detektiert, weshalb auf eine mangelnde Stabilität der Komponenten im in vitro System geschlossen wurde. Im in vivo System wurde zunächst die Optimierung der Expression forciert, wobei das entwickelte Expressions- und Biotransformationsprotokoll zu einer guten Reproduzierbarkeit in Ganzzellansätzen mit Standardabweichungen von unter 5 % geführt hat. Hierzu wurden frisch transformierte Zellen zur Anzucht (37 °C) in TB-Medium verwendet und bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,6-0,8 mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid induziert. Nach 20-stündiger Expression bei 25 °C wurden eine Zellsuspension mit 0,1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) und 20 mM Glucose (0,2 gBFM/mL) für Ganzzellumsätze hergestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des in Ethanol gelösten Substrates gestartet und nach 20 h bei 30 °C mit der Zugabe von Lösungsmittel gestoppt. Für die in vivo Untersuchung wurde ein semi-rationaler Mutageneseansatz gewählt, indem alle first shell Aminosäuren mit Alanin, Valin und Isoleucin (36 Varianten) ausgetauscht, sowie 25 Doppelvarianten an den Positionen A206, H295 und V260 generiert wurden. Mit dieser Bibliothek erfolgte die Identifizierung von wichtigen Struktur-Funktionsbeziehungen anhand von unterschiedlich substituierten Styrolderivaten und dem Monoterpen R-Limonen. Mit dem Einbringen einer Punktmutation in der aktiven Tasche konnten deutliche Veränderungen in der Reaktions- und Substratspezifität sowie in der Regio- und Stereoselektivität (≥ 90 %) beobachtet werden, wobei die Restaktivität gegenüber dem natürlichen Substrat Naphthalen (bis > 99 %) erhalten blieb. So stellten sich die Position A206, sowie die gegenüberliegenden Positionen H295, F202, F352, V260 und L307 in der planaren, zylinderförmigen aktiven Tasche als maßgeblich für die Steuerung der Aktivität und Selektivität der NDO dar. Generell konnte eine Abnahme der Aktivität mit steigender Substituentengröße und Verzweigungsgrad (Methyl- bis Pentyl- bzw. tert-Butyl-Reste) detektiert werden. Gleichfalls konnte eine Tendenz für ungesättigte Substituenten am Aromaten beobachtet werden, wobei die Aktivität von mono- über gem-di- und trans-di-substituierte Seitenketten abnahm. Bei der Untersuchung von unterschiedlichen Methoxystyrolderivaten konnte eine gesteigerte Spezifität und Stereoselektivität (≥ 95 %ee) beobachtet werden. Neben Hydroxylierungsreaktionen wurden hierbei auch Dealkylierungsreaktionen beobachtet. Die Dihydroxylierung wurde beim Vorliegen einer zum Aromaten konjugierten C=C-Doppelbindung gegenüber der O-Demethylierung bevorzugt. Lag die C=C-Doppelbindung isoliert zum aromatischen System vor, wurde hingegen eine Präferenz für die O-Demethylierung beobachtet. Grundsätzlich hat sich die NDO als einen guten Startpunkt für die biokatalysierte, asymmetrische Dihydroxylierung erwiesen und durch die systematische Analyse der aktiven Tasche konnten essentielle Stellschrauben für die weitere Verbesserung des Katalysator identifiziert werden.

The oxyfunctionalization of olefins is one of the most sought-after reactions in chemistry. Especially chiral vicinal 1,2-diols, afforded from asymmetric dihydroxylations, are often applied as chiral ligands, auxiliars or chiral synthons for pharmaceuticals and agrochemicals. In chemistry, a very powerful method for the stereoselective, asymmetric dihydroxylation (AD) of C=C double bonds is represented by the metal-catalyzed oxyfunctionalization via osmium (Sharpless AD) or other transition metals. Through extensive research in this field, high yields and excellent stereoselectivities are achieved with these catalysts. But their toxicity as well as the formation of byproducts through oxidative ring fission reactions represent major limitations in their applicability. Rieske non-heme dioxygenases (ROs) are the effective, biological alternative to the Sharpless AD. These multicomponent systems consist of a hexameric oxygenase, an electron shuttle molecule and a reductase. In nature, they dihydroxylate C=C double bonds in aromatic rings and therefore initiate degradation of arenes. Due to the availability of different crystal structures the naphthalene dioxygenase (NDO) from Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 was representatively investigated for the ROs and mutations in the active site were examined. By varying the substitution pattern, the direct catalysis at the aromatic ring as well as the allylic mono- and cis-dihydroxylation of the alkenyl side chain of a wide range of arenes (e. g. α-methylstyrene, allylbenzene) and the catalysis of non-aromatic, non-planar molecules like R-limonene were shown. Due to the broad biocatalytically repertoire of these enzymes the application for biotechnological purposes is of peculiar interest. To have a closer look at this catalyst the heterologous in vivo and in vitro expression in Escherichia coli was examined. Hereby, the in vitro investigation was focused on the interaction of the different components of the NDO, the reaction setup and the influence of the cosolvent. After optimization of the in vitro system the following parameters were defined: (I) ratio between the components with 1 μM oxygenase, 20 μM ferredoxin and 5 μM reductase, (II) the reaction setup with 2 mM substrate in ethanol at 30 °C for 2 h, and (III) the amount of the cosolvent ethanol with 5 %(v/v). With an alanine scan of twelve first shell amino acids in the in vitro system the positions A206, H295, L307, G204 and V260 seemed to be promising candidates for mutagenesis, although the allegedly low stability of the components in the in vitro system only led to minor product formation. Through optimization of the in vivo system a protocol for the expression and whole cell biotransformation was developed, which delivered a good reproducibility with standard deviations of less than 5 %. Freshly transformed cells were cultivated in TB-medium (37°C) until an optical density of 0,6-0,8 and then induced with 0,1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. The following heterologous expression was performed for 20 h at 25 °C. For whole cell biotransformations the cells were resuspended in 0,1 mM potassium phosphate buffer (pH 7,2) containing 20 mM glucose (0,2 gcww/mL). Reactions were started by adding the substrate (dissolved in ethanol) and stopped with the addition of solvent after 20 h at 30 °C. By using a semi-rational design approach in the in vivo system all twelve first shell amino acid residues were exchanged with either an alanine, a valine or an isoleucine (36 single variants) and additionally, based on in silico docking of R-limonene, 25 double variants were generated by combination of the positions A206, H295 and V260. By the screening of styrene derivatives as well as the monoterpene R-limonene important structure and function relationships were identified. The introduction of a single point mutation in the active site of the NDO had a clear influence on the reaction and substrate specificity as well as on the regio- and stereoselectivity (≥ 90 %), while the residual activity towards the natural substrate naphthalene (up to > 99 %) was not affected. Determining influences on the activity and selectivity of the NDO were identified at position A206 as well as at opposite positions H295, F202, F352, V260 and L307 of the planar cylindrical active site. In general, the activity dropped with an increasing size of the substituent as well as with increasing degree of branching (methyl- to pentyl- or tert-butyl-substituents). In case of the alkenyl side chains of the arene substrates the activity decreased from mono- to gem-di- to trans-di-substituted alkenes. Further investigation of different methoxystyrene derivates, however, showed an increase in specificity and stereoselectivity (≥ 95 %ee). By converting these para-methoxy substrates not only the allylic mono- and cis-dihydroxylation reactions were observed, but also the O-dealkylation. If the C=C double bond of the side chain was conjugated to the aromatic system a preference for the dihydroxylation was discovered, while with an isolated C=C double bond the O-demethylation was detected as a major product. In terms of selectivity and specificity is the NDO a good starting point for the selective, asymmetric dihydroxylation and the systematic analysis of the active site led to the discovery of crucial set screws for futher optimization of the catalyst.