Abstract

Adenosin-Rezeptoren (AdoR) zeigen als Komponenten des Adenosin-Signalweges komplexe Interaktionen untereinander, sowie mit weiteren Komponenten, wie der Ecto-5´-Nukleotidase (CD73) und der Adenosin-Desaminase (ADA). Diese Rezeptoren sind zudem mit den verschiedensten Signaltransduktionswegen verschaltet. Innerhalb dieser Arbeit sollten mögliche Mechanismen gemeinsamer potentieller Regulationen dieser Komponenten anhand von eukaryontischen Modellsystemen, wie auch anhand einer klinischen Studie zur chronisch lymphatischen Leukämie (CLL) untersucht werden. Für die Untersuchung transkriptioneller Regulationen wurde eine semiquantitative RT-PCR mit Hilfe eines heterologen Standards für alle 4 AdoR-Subtypen (A1, A2a, A2b, A3) etabliert. Die Spezifität dieser Systeme konnte mittels Restriktionsverdaus sowie Untersuchung von Transfektanten in AdoR-freien Zelllinien („Chinese Hamster ovary“ CHO) nachgewiesen werden. Densitometrische Auswertung der Amplifikate ermöglichte eine gute Quantifizierung der untersuchten mRNS-Niveaus, die noch Unterschiede in den subtypspezifischen cDNS-Niveaus von weniger als 40% deutlich auflöste. Für Untersuchungen in eukaryontischen Modellsystemen wurden C-terminale EGFPFusionskonstrukte aller 4 AdoR in pEGFP-N1 (Clontech) etabliert und in CHO- bzw. HeLa-Zelllinien transfiziert. Erfolgreicher Nachweis der Etablierung der Konstrukte erfolgte über Sequenzierung der neusynthetisierten Adaptersequenzen und über spezifische Restriktionsverdaus. Desweiteren konnte über die membranorientierte Fluoreszenzverteilung der Fusionskonstrukte in den Transfektanten auf eine erfolgreiche posttranslationale Prozessierung und Transport des Konstruktes in die Zellmembran zurückgeschlossen werden. RT-PCR-Analyse von RNS-Präparationen dieser Transfektanten zeigte eine erfolgreiche Transkription der Konstrukte. Innerhalb der HeLa-Zelllinie konnten alle 4 Subtypen erfolgreich exprimiert werden, wobei jedoch inhibitorische AdoR (A1AdoR; A3AdoR) leichter zu transfizieren waren als die excitatorischen A2aAdoR/A2bAdoR-Konstrukte. Letztere Transfektanten zeigten deutlich höhere Tendenzen zum Absterben, was mit einem erhöhtem cAMPNiveau dieser Zellen zusammenhängen könnte. Physiologische Aktivität des A3AdoR-Konstruktes konnte durch Verminderung der Teilungsrate der Transfektante beobachtet werden. Innerhalb der einzelnen Transfektanten konnten keine großen Änderungen der mRNS-Niveaus des entsprechenden transfizierten Subtypen festgestellt werden, was mit einer „Downregulation“ des nativen Subtypes erklärbar sein könnte. Jedoch zeigten sich zum Teil deutliche Niveau-Änderungen in den jeweils anderen Subtypen der Transfektante, was auf eine Interaktion der AdoR-Subtypen auf der Transkriptionsebene hindeutet. Verschiedene Wechselbeziehungen könnten mit - zum Teil von physiologischen Interaktionen her- bekannten Beziehungen der AdoR in verschiedenen Zelltypen in Zusammenhang gebracht werden. Induktion der Transfektanten mit AdoR-Agonisten, wie 5`-N-Ethyl-Carboxamido- Adenosin (NECA) oder (R)-N6-(1-Methyl-2-phenylethyl)-Adenosin (R-PIA) ergab einen Anstieg aller AdoR-cDNS-Niveaus im Falle der Aktivierung der Adenylylcyclase (A2a/A2bAdoR), bzw. eine Abnahme bei deren Inhibierung (A1/A3AdoR), die auch zum Teil subtypabhängige Modulationen und deutliche Abweichungen zur Kontrolllinie (EGFP-HeLa) zeigte. Behandlung der Zellen mit Alkohol als apoptosisstimulierendes Signal führte zu einer starken Erhöhung aller Subtyp-Niveaus, wobei besonders die A2aAdoR- und die A3AdoR-Transfektante die größten apoptotischen Tendenzen und auch die größten Modulationen der Subtyp-Niveaus zeigten. Transfektion der Konstrukte in die CHO-Zelllinie ergab gut exprimierende Klone der A1AdoR- und A3AdoR-Transfektante, die über membranorientierte Fluoreszenz des EGFP-Anhanges, wie auch über Nachweis der mRNS nachgewiesen werden konnten. Im Falle der excitatorischen AdoR erhielt man nur schwach exprimierende Klone der A2aAdoR-Transfektante, die deutliche Tendenzen zum Absterben zeigte. Wiederum fand man bei der A3AdoR-Transfektante einen erheblich verlangsamten Zellzyklus, was auf einer zellzyklusmodulierenden Wirkung des A3AdoR in verschiedenen Zelltypen beruht und somit auf eine erfolgreiche Signalfortleitung in der Transfektante hindeutet. Induktion der A1AdoR-Transfektante führte zu einer zeitabhängigen Konzentrierung und Internalisierung der Fluoreszenz, was auf eine intakte Regulation und Desensibilisierung dieses Subtypes innerhalb dieses Klones hindeutet. Die B-lymphoblastoide Zelllinie Raji wurde als Modellsystem für AdoR-Signalwege innerhalb des lymphatischen Systems untersucht. Eine starke Präsenz des A2aAdoR konnte mittels RT-PCR nachgewiesen werden, dessen Stimulation mit dem AdoR-Agonisten NECA wiederum zu einem Anstieg der mRNS-Niveaus aller AdoR-Subtypen führte. Behandlung mit Alkohol führte zu einem größeren Anteil an absterbenden Zellen sowie zu einem leichten Anstieg aller AdoR-Subtypen und deutet wiederum auf eine Beteiligung der AdoR an apoptotischen Antworten hin. Inwiefern substratmodulierende Komponenten des AdoR-Signalweges, insbesondere CD73 und ADA, in Regulationsmechanismen dieses Weges integriert sind, wurde in einem induzierbaren B-lymphoblastoiden Modellsystem, der 493-6-Zelllinie untersucht. Hierbei wurden durch induzierbare transkriptionelle Aktivierung zweier Mitogene, c-myc und EBNA2, vier unterschiedliche proliferative Zustände erzeugt und die Auswirkungen auf die Komponenten des Ado-Signalweges untersucht. Northern Blot-Analyse der 4 Zustände zeigten eine Zunahme der CD73- und A2aAdoR-mRNS-Niveaus mit sukzessiver Abschaltung der Mitogene, wobei EBNA2- Abschaltung den deutlichsten Effekt zeigte. ADA-mRNS-Niveaus zeigten meistens eine leichte Abnahme mit Abschaltung der Mitogene, was aber nicht eindeutig bestätigt werden konnte. Untersuchung der Zustände mit semiquantitativer RT-PCR ergaben eine Präsenz aller AdoR mit einer starken Überrepräsentierung des A2aAdoR. Wiederum konnte mit sukzessiver Abschaltung der Mitogene ein deutlicher Anstieg des A2aAdoR beobachtet werden, der wiederum deutlicher bei Abschaltung von EBNA2 ausfiel. Andere AdoR-Subtypen zeigten jedoch so gut wie keine Respons. Abschaltung der Mitogene führte sowohl bei EBNA2, wie auch bei cmyc nach ca. 3 bis 6 Stunden zu einem deutlichen Anstieg der A2aAdoR-Niveaus, sowie generell zu einer Abnahme des ADA-Niveaus im Falle der c-myc-Abschaltung. NECA-abhängige Erhöhung des cAMP-Niveaus korrelierte mit den A2aAdoRNiveaus der entsprechenden Proben. Ebenso konnte in diesem Labor eine Erhöhung der CD73-Aktivität mit Abschaltung der Mitogene nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle des A2aAdoR bei der Bereitstellung mitogener Signale und einer damit verbundenen Gewährleistung des Überlebens dieser Zelllinie bei inaktivierten Mitogenen, sowie auf modulatorische Interaktionen zwischen der CD73 und A2aAdoR hin. Modulierte CD73-Aktivitäten und Beteiligung der AdoR an apoptotischen Vorgängen in der chronisch lymphatischen Leukämie sind bereits länger bekannt. Innerhalb einer klinischen Studie zur CLL wurden 48 Patienten und 10 Kontrollpersonen auf Modulationen der AdoR-, sowie c-myc- als auch ADA-Niveaus, untersucht und auf eine klinische Relevanz hin überprüft. Im Bezug auf den Mittelwert der Kontrollgruppe konnten oft Modulationen der mRNSNiveaus der untersuchten Komponenten innerhalb der Patientengruppe gefunden werden. Korrelationsanalyse der Patientendaten ergab verschiedene Zusammenhänge der AdoR, wie auch der c-myc und der ADA untereinander, die zum Teil gegenläufig zu denen in der Kontrollgruppe waren. A2aAdoR-Niveaus korrelierten negativ mit der Leukozytenanzahl, einem Marker der CLL. Es konnte auch ein deutlicher Zusammenhang zwischen der CD73-Aktivität und der Leukozytenanzahl in diesem Labor gezeigt werden. Ebenso fand man einen starken Zusammenhang zwischen den c-myc- und ADANiveaus, sowie zwischen der ADA bzw. c-myc und diversen AdoR-Subtypen. Diverse, aus physiologischen Zusammenhängen bekannte Korrelationen fand man auch in der CLL wieder, was auf eine geregelte Modulation der AdoR-Niveaus in der CLL hindeutet, wobei jedoch keine Zusammenhänge mit den prognostischen Stadien nach Binet gefunden werden konnten. Ein aktive Modulation des A2aAdoR bei der Expansion der malignen B-Lymphozyten konnte anhand der Ergebnisse von 4 Folgeuntersuchungen vermutet werden. Wiederholung der Untersuchung nach 6 Monaten bis zu 1,5 Jahren zeigte eine deutliche negative Korrelation der Leukozytenzahl mit dem A2aAdoR-Niveau.