One emerging surgical strategy for restoring a normal corneal epithelial surface in patients with limbal stem cell (SC) deficiency is transplantation of ex vivo expanded limbal epithelial SC which represents one of the few adult human SC therapies being currently employed. In unilaterally affected patients, this therapeutic approach commonly involves the harvest of a small limbal biopsy from the patient´s contralateral healthy eye followed by cell expansion ex vivo to generate an epithelial sheet on a transplantable carrier such as amniotic membrane or fibrin gel. Although successful restoration of the ocular surface occurs in the early postoperative period, the long-term outcome is less satisfactory, most probably due to depletion of limbal SC in culture. In patients with bilateral limbal SC deficiency, cadaveric donor eyes or alternative autologous SC sources such as oral mucosa or conjunctiva are required which, however, have provided less satisfactory long-term clinical outcomes so far. Therefore, present research activities focus on the evaluation of further alternative autologous SC sources for ex vivo culture and transplantation avoiding the risk of immune-mediated rejection or the need for immunosuppression. In this work an improved culture protocol was established for isolation, enrichment and preservation of limbal epithelial stem and progenitor cells within transplantable cultivated epithelial cell sheets. These fibrin-based epithelial cell sheets should be therapeutically employed for ocular surface reconstruction for patients suffering from unilateral limbal SC deficiency. Clonal analysis showed that limbal cells obtained from the superior limbus, isolated by a gentle two-step enzymatic dissociation method (dispase II/trypsin-EDTA), cultured in low to medium (0.03-0.4 mmol/l) calcium concentrations with proper serum levels (10%) and growth factor combinations (EGF/NGF) yielded the highest clonal growth capacity and an undifferentiated cellular phenotype. Subsequent subcultivation of clonal cells on fibrin gels supported the preservation of stem and progenitor cells within the transplantable epithelial cell sheets as demonstrated by multiple molecular SC markers. The transdifferentiation experiments showed that both murine and human hair follicle (HF)-derived epithelial SC could be induced to transdifferentiate into a corneal-epithelial-like phenotype, when exposed to a limbus-specific microenvironment, i.e. laminin-5 as substrate and conditioned medium from limbal stromal fibroblasts. These limbal niche factors significantly upregulated expression of cornea-specific K12- and Pax6- mRNA and protein, whereas expression of the epidermal keratinocyte marker K10 was significantly downregulated. These findings indicate, that using clonal expansion, subcultivation of clonal cells on fibrin gels, and specific culture methods, which support enrichment and preservation of the SC phenotype during the entire cultivation process, multilayered transplantable sheets of epithelial cells can be generated from small human limbal biopsy specimens. This proposed culture system may be essential for a long-term clinical success and a wide-spread use of this SC-based therapy and may contribute to restoration of the ocular surface in patients with unilateral limbal SC deficiency. Furthermore, HF may be an easily accessible alternative source of autologous adult SC and a promising therapeutic tool for replacement of the corneal epithelium and restoration of visual function in patients with bilateral ocular surface disorders.

Eine der neueren operativen Strategien zur Wiederherstellung der gesunden Hornhautepitheloberfläche bei Patienten mit limbaler Stammzellinsuffizienz ist die Transplantation von ex vivo expandierten limbalen epithelialen Stammzellen, welche eine der wenigen derzeit verwendeten Therapieansätze mit Einsatz von adulten Stammzellen repräsentiert. Bei Patienten mit einseitiger limbaler Stammzellinsuffizienz umfasst dieser Therapieansatz normalerweise die Entnahme von kleinen limbalen Gewebebiopsien vom gesunden Partnerauge des Patienten, die Isolation und ex vivo - Expansion der epithelialen Stammzellen sowie die Kultivierung eines epithelialen Zellverbands auf transplantierbarem Trägermaterial, wie z.B. Fibringel oder Amnionmembran. Trotz erfolgreicher Rekonstruktion der Augenoberfläche in der frühen postoperativen Phase ist der Langzeiterfolg dieser Therapiestrategie bislang wenig zufrieden stellend, was wahrscheinlich auf eine zu geringe Zahl an im Transplantat vorhandenen Stammzellen zurückzuführen ist. Bei Patienten mit bilateraler limbaler Stammzellinsuffizienz werden entweder Limbus-Gewebe von Spenderaugen oder andere autologe Stammzellquellen, wie z.B. Mundschleimhaut oder Bindehaut, benötigt, womit allerdings bisher wenig zufrieden stellende klinische Langzeitergebnisse erzielt werden konnten. Deshalb konzentrieren sich derzeitige Forschungsschwerpunkte auf die Evaluierung weiterer alternativer autologer Stammzellquellen zur Rekonstruktion und Transplantation von Hornhautepitheläquivalenten, um die Risiken einer immunologischen Abstoßung oder immunsuppressiven Therapie zu umgehen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten experimentellen Arbeiten bezüglich der Optimierung der Zellkulturbedingungen zeigten, dass die vom superioren Limbus gewonnenen Stammzellen, die mittels einer zweistufigen enzymatischen Dissoziationsmethode (DispaseII/Trypsin-EDTA) isoliert, und in Kulturmedium mit niedriger bis mittlerer Kalziumkonzentration (0,03 – 0,4 mmol/l), geeigneter Serumkonzentration (10%) und Wachstumsfaktorkombination (EGF/NGF) kultiviert wurden, die höchste klonale Wachstumskapazität und einen undifferenzierten Phänotyp aufwiesen. Die anschließende Subkultivierung der klonal angereicherten Zellen auf Fibringelen förderte die Erhaltung der Stamm- und Vorläuferzellen in den zu transplantierenden Zellschichten, was mit Hilfe zahlreicher molekularer Stammzellmarker nachgewiesen werden konnte. Die Transdifferenzierungsexperimente legten dar, dass sich sowohl murine als auch humane Haarfollikel Stammzellen in einen Hornhautepithel-ähnlichen Phänotyp differenzieren konnten, wenn sie limbus-spezifischen exogenen Faktoren, wie z.B. Laminin-5 als Substrat und konditioniertem Medium aus limbalen stromalen Fibroblasten, ausgesetzt wurden. Unter dem Einfluss dieser limbalen Nischenfaktoren stieg die Expression Hornhaut-spezifischer Marker, wie K12- und Pax6- mRNA und Protein, in den Haarfollikelzellen signifikant an, während die Expression epidermaler Keratinozyten-Marker, wie K10, signifikant herunterreguliert wurde. Diese Ergebnisse belegen, dass mittels klonaler Expansion, Subkultivierung der klonal angereicherten Stammzellen auf Fibringelen und spezifischer Kultivierungsmethoden, die die Anreicherung und Erhaltung des Stammzell-Phänotyps während des gesamten Kultivierungsprozesses fördern, mehrschichtige transplantierbare Epithelzellschichten aus kleinen limbalen Biopsaten hergestellt werden können. Dieses entwickelte Kultivierungssystem könnte essentiell für einen langfristigen klinischen Erfolg und eine weit verbreitete Anwendung dieser Stammzell-basierten Therapiestrategie sein und zur dauerhaften Wiederherstellung der Augenoberfläche bei Patienten mit unilateraler Stammzellinsuffizienz beitragen. Darüber hinaus könnten Haarfollikel eine leicht zugängliche Quelle adulter autologer Stammzellen mit viel versprechendem therapeutischem Potenzial für den Ersatz des Hornhautepithels und die Wiederherstellung des Sehvermögens bei Patienten mit bilateralen Erkrankungen der Augenoberfläche darstellen.