Inducible systems for the characterization of insulating and repressing motifs
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Abstract
Genes in the eukaryotic genome are surrounded by regulatory elements, which can affect gene expression in a positive or negative manner. To protect neighbouring, independently-controlled genes from such inappropriate influences, specific DNA-sequence elements exist, so called insulators. On the one hand, they block the encroachment of heterochromatin and, on the other hand, they block position dependent enhancer action. Different models have been proposed to explain the mode of action of insulators. Structural models describe independent chromatin loops bordered by insulators that separate the genome into active and inactive regions. The stable integration of an inducible loop-forming system into HeLa cells could give insight into the mode of action of insulators and support the data from transient measurements. In the first part a recombinase-based cassette exchange system was stably integrated into HeLa cells to allow the insertion and comparison of different loop-forming systems in the absence of position variegation effects. An asymmetric Cre/lox system was integrated at a silent, but activatable locus to exclude influences from endogenous regulatory elements. However, the subsequent cassette exchange using the Cre/lox system did not lead to the expected phenotype. Thus, this system seems not to be suitable for such an application. The sole vertebrate insulator binding protein known to date is CTCF which is not only involved in insulation but also in repression. To further characterize this repressive function it is necessary to analyze the functional domain through mutation-analysis and to find novel interacting partners. In the second part of this work, the multivalent transcription factor CTCF was functionally characterized. To identify potential dimerization domains of CTCF, both the yeast two-hybrid and the loop-forming systems were used. Dimerization between the N- and the C-terminus was tentatively assumed, but the results were ambiguous due to intrinsic regulatory activity of the N-terminal domain. To characterize the repressive function of the N terminus, alanine mutants revealed a 12 residue stretch, harboring seven specific amino acids, which are responsible for repression at different promoters in both HeLa and COS-7 cells. Novel interacting partners of CTCF were identified by yeast two-hybrid analysis with either a peptide library or a cDNA library from bone marrow. One component of the minichromosome maintenance complex, Mcm7, was identified both by yeast two-hybrid and co-immunoprecipitation experiments as an interaction partner of CTCF, interacting specifically with the repression domain located within the N terminus. Also the Smc1 subunit (structural maintenance of chromosomes 1) of the cohesin complex, which is responsible for the cohesion of sister chromatids was found in the precipitates. As both Mcm7 and Smc1 are involved in transcriptional repression, these interactions suggest an interplay between the DNA replication and transcription regulation machineries.
Abstract
Im eukaryotischen Genom sind Gene umgeben von regulatorischen Elementen, die deren Expression positiv oder negativ beeinflussen. Um benachbarte, unabhängige Gene vor diesen Einflüssen zu schützen, existieren spezifische DNA Sequenzbereiche, sogenannte Isolatoren. Verschiedene Modelle beschreiben die Funktionsweise von Isolatoren, die zum einen das Einwandern von Heterochromatin verhindern und zum anderen die Wirkung von Enhancern positionsabhängig blockieren. Strukturelle Modelle beschreiben die Ausbildung von unabhängigen Chromatindomänen, wobei Isolatoren aktive und inaktive Bereiche voneinander trennen. Ein induzierbares Schleifenbildungs-Modell stabil in HeLa Zellen zu integrieren, könnte Aufschluss über die Funktionsweise von Isolatoren geben und die bereits transient gemessenen Daten unterstützen. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Rekombinase basiertes Allelaustauschsystem stabil in HeLa Zellen integriert um dort positionsunabhängig schleifenbildende Systeme einbringen und vergleichen zu können. Das Cre/lox System wurde an einen stillen aber aktivierbaren Ort integriert, um Einflüsse von endogenen regulatorischen Elementen auszuschließen. Der darauffolgende Austausch über das Cre/lox System führte jedoch nicht zum erwarteten Phänotyp, so dass das System für eine solche Anwendung nicht geeignet scheint. Das bis heute einzige in Vertebraten gefundene Isolatorprotein ist CTCF, das neben seiner Isolationsfunktion weitere Eigenschaften besitzt und so auch an Repression im menschlichen Genom beteiligt ist. Um diese Repressionsfunktion zu charakterisieren, ist es notwendig, die funktionale Untereinheit, die für diese Aufgabe zuständig ist, durch Mutationsanalysen genauer zu definieren und neue Interaktionspartner zu finden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die funktionalen Domänen des Transkriptionsfaktors CTCF näher charakterisiert. Um Hinweise über die zur Dimerisierung von CTCF verantwortlichen Domänen zu erlangen wurden das Hefe-Zwei-Hybrid- und das Schleifenbildungs-System verwendet. Es gab Hinweise auf eine Dimerisierung zwischen N- und C-terminus, die jedoch auf Grund intrinsischer Repressions-Aktivität nicht eindeutig waren. An Hand von Alanin Mutanten wurden sieben spezifische Aminosäuren innerhalb eines zwölf Aminosäuren-Bereiches identifiziert, die für die Repressionseigenschaften der N-terminalen Domäne verantwortlich sind. Die hierüber vermittelte Repression konnte an CMV- und SV40- Promotoren sowohl in HeLa als auch in COS-7 Zellen gezeigt werden. Neue Interaktionspartner von CTCF wurden über Hefe Zwei-Hybrid Analysen mit einer Peptid Bibliothek und mit einer cDNA Bibliothek gefunden. Eine Komponente des Minichromosome maintenance complex, Mcm7, wurde sowohl über Hefe Zwei-Hybrid als auch über Ko-Immunopräzipitations-Experimente als Interaktionspartner von CTCF, speziell mit der Repressionsdomäne innerhalb des N-terminus, identifiziert. Eine Interaktion mit Smc1 (Structural maintenance of chromosomes 1), einer Untereinheit des Cohesin Komplexes, der für die Kohäsion der Schwesterchromatiden verantwortlich ist, konnte ebenfalls gezeigt werden. Da sowohl Mcm7 als auch Smc1 an Transkriptionsrepression beteiligt sind, geben diese Interaktionen möglicherweise Aufschluss über Zusammenhänge zwischen DNA Replikation and Transkriptionsregulation.