Novel oligopeptides controlling Tet repressor-based gene regulation
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So far, the tetracycline repressor TetR used for gene regulation was solely induced either by tetracycline (tc) or its derivatives and the 17-mer WTIP (= transcription inducing peptide). This peptidic inducer of TetR triggers allostery similarly to tc by binding to partially overlapping regions of the effector binding domain, though it is not based on the structure of tc. Within this study, binding and induction of TetR by WTIP, fused to the C- or N-terminus of the scaffold protein thioredoxin A (TrxA-WTIP), was characterized in vivo and in vitro. Despite, induction of TetRF86A by TrxA-WTIP exhibited the most effective combination for TetR induction by a C terminal TrxA fusion, the determination of the binding constant of TrxA-WTIP and TetRF86A was not successful by thermodynamic analysis. However, native PAGE confirmed binding, when the mixture of the interacting components contained an excess of TrxA-WTIP. An in vivo screening system was constructed in Saccharomyces cerevisiae to identify novel TetR interacting peptides for gene regulation. A histidin auxotrophic yeast strain, transformed with two plasmids, encoded chromosomally the complementing his3 allele under control of TetR. The first vector expressed TetR, as well as a 16mer peptide pool, fused to a transcription activator. The second plasmid encoded the green fluorescent protein (GFP+) as an additional marker, under the same TetR control as his3. The novel system exhibited autonomous reporter gene activity and could, therefore, not be applied. In contrast, Y2H screening was successful and yielded 63 novel TetR(B) binding peptides. This screen used monomerized TetR, fused to the GAL4 DNA binding domain, as “bait”, as well as a 16mer peptide pool, fused to the C terminus of the GAL4 activation domain, as “prey”. Further characterization of the peptides as C terminal fusions to TrxA, was performed in E. coli. 22 novel inducers of TetR were identified. One of them showed significantly increased induction as compared to WTIP. Eleven of the isolated peptides acted as antagonists of tc or dox mediated TetR induction, and one as co repressor of the reverse TetR(B). Alanine scanning resulted in three major findings. First, P5(L9A) is the most effective inducer of TetR(B), second, P36(G7A) is the best antagonist of tc and dox and, third, II21 exhibits the first peptidic co repressor of revTetR(B). Induction, anti induction and co repression properties did not depend on TrxA as scaffold protein. This was confirmed by similar activities of the peptides when fused to the C-terminus of the Maltose binding protein and for P5(L9A) even as fusion to VP16. The specificity determinants for peptide binding to TetR are partially overlapping with the ones for binding of tc and WTIP. In addition, Y2H screening was performed with reverse TetRr2 as “bait” and yielded 61 binding peptides. Finally, the in vivo system, which is based on the E. coli strain WH207(λtet50) for characterization of TetR effectors, was modified for the identification of peptidic anti-inducers after peptidic induction of TetR. The strain was transformed with a third plasmid, which expresses the anti-inducers as fusion to VP16 under control of PBAD. Thereby, P36(G7A) was also identified as effective anti-inducer for TIP mediated TetR induction.
Abstract
Bisher wurde der Tetrazyklinrepressor TetR in der Genregulation ausschließlich mit Tetrazyklin (tc) oder dessen Derivaten und dem 17-mer Peptid WTIP (= Transkription induzierendes Peptid) induziert. Dieser peptidische Induktor von TetR, welcher nicht auf der Struktur von tc basiert, vermittelt Allosterie auf ähnliche Weise wie tc. Dies wird durch Bindung teilweise gleicher Reste der Effektorbindetasche erreicht. Innerhalb dieser Arbeit wurden Bindung und Induktion von TetR durch WTIP, welches an den C- oder N terminus von ThioredoxinA (TrxA) fusioniert ist, durch in vivo und in vitro Messungen charakterisiert. Obwohl die Induktion von TetRF86A durch TrxA-WTIP derzeit die aktivste Kombination zur Induktion von TetR durch eine C terminale TrxA-Peptidfusion darstellt, konnte eine Dissoziationskonstante für TrxA WTIP und TetRF86A nicht durch thermodynamische Analysen ermittelt werden. Bindung wurde dennoch bei nativen PAGE beobachtet werden, wenn im Gemisch der Komponenten TrxA WTIP im Überschuss eingesetzt wurde. Neue TetR-interagierende Peptide sollten durch ein in vivo Auswahlverfahren in Saccharomyces cerevisiae identifiziert werden. Ein Histidinauxotropher Hefestamm, welcher mit zwei Vektoren transformiert wurde, kodierte chromosomal das komplementierende his3 Allel unter TetR Kontrolle. Der erste Vektor exprimiert TetR und einen 16mer Peptidpool, der an eine Aktivatordomäne fusioniert vorlag. Der zweite Vektor kodiert für das grün fluoreszierende Protein (GFP+) als zusätzlichen Marker. GFP+ wird unter identischer TetR Kontrolle wie his3 exprimiert. Das konstruierte System zeigte autonome Reportergenaktivität und konnte daher nicht erfolgreich eingesetzt werden. Im Gegensatz dazu führte das Yeast two-hybrid (Y2H) Auswahlverfahren zur Isolierung von 63 neuen Peptiden, die TetR der Klasse B binden. Monomerisierter TetR wurde an die GAL4 DNA Bindedomäne fusioniert und diente als „bait“ Protein. Außerdem wurde ein 16mer Peptidpool an die GAL4 Aktivatordomäne fusioniert („prey“ Protein). Die isolierten Peptide wurden als C-terminale Fusion an TrxA in E. coli weiter charakterisiert. Hierdurch wurden 22 neue Induktoren für TetR identifiziert. Von diesen zeigte eines eine deutlich verbesserte Induktionseffizienz als WTIP. Elf Peptide waren als Antagonisten von tc oder doxycycline vermittelter TetR Induktion aktiv und eines als Co-Repressor des reversen TetR(B). Durch Alanin-Scanning wurde P5(L9A) als bislang effektivster Induktor von TetR(B) idenzifiziert, P36(G7A) als bester Antagonist und II21 als erster peptidischer Co Repressor von revTetR(B). Die Peptideigenschaften wie Induktion, Anti-Induktion und Co Repression werden nicht durch das Trägerprotein TrxA vermittelt. Dies wurde dadurch nachgewiesen, dass die C terminalen Fusionen der Peptide an das Maltose bindende Protein und von P5(L9A) auch an VP16 ähnliche Aktivitäten zeigten. Desweiteren wurden die Spezifitäts-determinanten von TetR für die peptidische Interaktion bestimmt. Diese erwiesen sich als teilweise übereinstimmend mit denen von tc und WTIP. Außerdem wurde das Y2H Auswahlverfahren angewandt, um Binder für den reversen TetRr2 zu isolieren. Dabei ergaben sich 61 bindende Peptide. Weiterhin wurde das in vivo System, welches auf dem E. coli Stamm WH207(λtet50) zur Charakterisierung von TetR Effektoren basiert, modifiziert. Dieses konnte zur Identifizierung von peptidischen Anti Induktoren nach peptidischer Induktion von TetR angewandt werden. Der Stamm mit einem dritten Vektor zur Expression von Anti induktoren als VP16 Fusion unter Kontrolle des PBAD transformiert. Somit wurde P36(G7A) auch als effizienter Antagonist für eine Induktion von TetR durch TIP identifiziert.